TUSC5剪接异构体调控葡萄糖转运蛋白GLUT4介导脂肪沉积的机制研究

We detected that TUSC5, one candidate gene for cattle adipogenesis, produced two isoforms (TUSC5a and TUSC5b) specifically in the adipose tissue. The TUSC5 was proved that played key roles during adipogenesis modulated by GLUT4 in human and mouse studies but did not consider the alternative splicing event. In this application, we will clarify the questions that weather and how the two isoforms play roles during adipogenesis in cattle. We will make it clear that the effects on the adipogenesis for TUSC5a and TUSC5b using a gradient knock-down/over-expression strategy. Then we will check their interaction and localization with GLUT4, and analyze their roles in the GLUT4 translocation and recycling to screen the necessary TUSC5 isoforms during adipogenesis modulated by GLUT4. Moreover, we will find out the fundamental mechanisms of adipogenesis differences generated by the different amino acid sequences between TUSC5a and TUSC5b in the protein-protein interaction level. This will be the first detailed study considering alternative splicing events for the candidate genes related to cattle adipogenesis, which will be very important to fully and correctly uncover the networks of adipogenesis regulated by TUSC5, and will supply materials for the cattle molecular breeding reasonably and safely.

我们发现牛脂肪沉积候选基因TUSC5存在两种不同剪接异构体：TUSC5a和TUSC5b。但之前人和小鼠中的研究没有考虑可变剪接的存在，认为TUSC5是葡萄糖转运蛋白GLUT4介导脂肪沉积的关键基因。为了阐明TUSC5两种剪接异构体是否、以及如何对牛脂肪沉积发挥调控作用，本项目将利用梯度敲低/超表达的策略，明确TUSC5a和TUSC5b对脂肪细胞摄取葡萄糖-脂肪沉积途径的作用；进一步通过co-IP、亚细胞组分分离等技术，分别检测二者与GLUT4的互作定位关系以及调控GLUT4转位和循环的关键作用，从而鉴定在GLUT4介导的脂肪沉积途径中发挥作用的TUSC5剪接异构体类型；最后，从蛋白-蛋白互作层面揭示二者由于氨基酸序列不同造成脂肪沉积机制变异的根本原因。本项目率先对牛脂肪沉积候选基因的功能研究深入到可变剪接水平，有利于充分理解TUSC5的调控网络，推进该基因在肉牛分子育种中的合理和安全利用。

脂肪沉积能力是影响肉牛肉质性状的关键因素。充分和正确理解脂肪沉积机理是从分子水平改良肉牛品种的前提条件。目前，可变剪接对正确理解基因功能的重要性已经引起广泛关注。我们之前鉴定出TUSC5可以作为调控肉牛脂肪沉积的重要候选基因，并发现TUSC5基因在牛脂肪组织中特异性存在两种不同剪接异构体（TUSC5A和TUSC5B），推测其对对脂肪沉积的调控可能存在差异。针对此假设，本项目解析了TUSC5A和TUSC5B对脂肪沉积的影响及其调控机制，重要研究结果如下。.成功构建了牛TUSC5A和TUSC5B超表达/干扰细胞模型，阳性细胞纯度在98%以上；TUSC5两种不同剪接异构体对脂肪细胞的增值和成脂分化的影响研究显示超表达TUSC5B可显著引起脂肪细胞凋亡，而TUSC5A则对脂肪细胞的增值分化没有显著影响，脂肪细胞的成脂分化研究显示两者呈现相反的效果，TUSC5A会显著促进脂肪细胞的成脂分化，而TUSC5B会显著抑制脂肪细胞的成脂分化，利用qPCR和WB等技术对成脂分化不同阶段标志基因表达量的检测分析也进一步从分子水平验证了TUSC5A和TUSC5B对脂肪细胞相反的功能效应；利用转录组测序深入分析显示PPAR等信号通路是TUSC5A和TUSC5B对脂肪细胞成脂分化产生差异调控的关键；生物信息学、细胞荧光共定位等研究发现正常情况下TUSC5A和TUSC5B均和GLUT4在细胞质中互作，但在胰岛素刺激的条件下，TUSC5A会发生入核反应，而TUSC5B则依旧在细胞质中与GLUT4互作发挥作用，证明了TUSC5B是TUSC5与GLUT4互作的关键可变剪接异构体；同时结合转录组测序和关键基因定量分析结果，推测TUSC5两种可变剪接异构体在胰岛素刺激的作用下调控方式发生差异变化，TUSC5A进入细胞核影响PPAR等信号通路调控脂肪细胞成脂分化，而TUSC5B在细胞核中参与GLUT4囊泡转运调控脂肪细胞成脂分化，从而形成两种不同的调控机制。.本研究证明了TUSC5两种不同剪接异构体对脂肪沉积产生了相反的作用，并揭示了两者差异调控的关键机制，将TUSC5基因调控网络的认识细化到不同剪接异构体水平，暗示了TUSC5两种不同剪接异构体可能成为人工调控脂肪沉积能力的有效工具，为其将来分子育种安全合理的应用提供保障。