排毒保肾方调控TGF-β1/整合素信号途径对肾纤维化的影响

肾小管间质纤维化是导致终末期肾病的主要病理基础，决定慢性肾脏病患者的病程和预后，因此抑制肾纤维化的有效药物急盼问世。我们课题组前期探讨了肾小管上皮细胞-肾间质肌成纤维细胞转分化（TEMT）中TGF-β1/Smad通路外新的信号通路机制，发现TEMT过程中TGF-β1与整合素信号通路通过粘着斑激酶相互作用。因此对于整合素信号途径的调控可能成为抑制肾纤维化的新靶点。课题组遵"去菀陈莝"法创立排毒保肾方，经临床实践发现该方可降低慢性肾功能不全患者血清纤维化指标。本课题在此基础上，以单侧输尿管梗阻制作的大鼠肾间质纤维化模型和人近端肾小管上皮（HKC）为研究平台，采用诱导或阻遏基因表达、Real-Time PCR、Western blot、激光共聚焦显微技术等方法，对比分析排毒保肾方是否通过调控TGF-β1/整合素信号途径影响肾纤维化，以明确该方抗肾纤维化的作用靶点，为其推广应用提供实验依据。

第一部分 排毒保肾方主要水溶性成分之一丹酚酸B对人肾小管上皮细胞转分化过程的干预效应与机制研究.用TGF-β1刺激HK-2，用排毒保肾方主要水溶性成分之一丹酚酸B（SA-B）、ERK抑制剂PD98059及钙通道拮抗剂Nifedipine处理；于不同时间段分用免疫荧光、S-P法和免疫印迹的方法检测FAK、整合素β1。 结果显示：1. 相比空白组TGF-β1成功诱导HK-2转分化；2. TGF-β1刺激15min后FAK-Tyr397磷酸化增强,60min达顶峰。相比TGF-β1对照组，PD98059使FAK-Tyr397的磷酸化减弱而Nifedipine无明显抑制作用，PD98059与Nifedipine协同作用明显，SA-B具有同样抑制作用；3. 相比对照组,PD98059、SA-B使FAK蛋白表达呈时间依赖性减弱, PD98059与Nifedipine协同作用明显；4. PD98059及Nifedipine均呈时间依赖性抑制β1-Integrin表达，两者协同作用明显；SA-B有效抑制β1-Integrin表达。.第二部分 排毒保肾方主要水溶性成分之一β榄香烯对TGF-β刺激的HMC表达CTGF和FN的影响.将HMC分为6组（空白对照组，TGF-β刺激组，低、中及高浓度β榄香烯组，秋水仙碱干预组），结果显示β榄香烯能抑制TGF-β诱导的肾小球系膜细胞增殖并下调该细胞CTGF和FN的表达。.第三部分 TGF-β/整合素信号通路与肾纤维化的关系及排毒保肾方的干预效应.将24只大鼠随即分为UUO模型组，假手术组和排毒保肾方治疗组。结果显示模型组TGFβ1、整合素α5β1、α-SMA 及E-cadherinmRNA与蛋白表达明显增多，排毒保肾方可下调其表达；.第四部分 排毒保肾方含药血清对TGF-β1刺激的人肾小管上皮细胞表达α-SMA及CTGF的影响.体外培养HKC，结果显示：经TGF-β1诱导48h后，单纯干预组α-SMAmRNA表达较正常对照组显著增加，而不同剂量含药血清均可抑制α-SMAmRNA表达。随着排毒保肾方含药血清剂量升高，α- SMAmRNA表达量呈下降趋势。单纯TGF-β1干预组CTGF蛋白表达水平较正常对照组显著增加，其中，高、中、低剂量含药血清组CTGF蛋白表达水平依次为2.50±0.577、3.50±1.00、5.00±0.82。