新型转基因植物防龋疫苗的研制及其口服免疫机制研究

Streptococcus mutans（S.mutans）is the main pathogenic bacteria of dental caries. Surface protein(PAc) and glucocyltransferases (GTF) are considered as the important virulence factors of S.mutans. This research intends to clone the surface protein adhesion the relared peptide of the S.mutans and catalytic function of GTF gene, which contain T,B lymphocytes cell antigenic epitopes,to clone adjuvant CTB and the gene of DHR which is in core functional domain of targeting protein DOCK8 . After the genes modified by adding the signal peptide form plant, targeting sequence in the endoplasmic reticulum and flexible peptide, the chimera gene be inserted to plant expression vector carrying tomato fruit specific promoter. Then to transform tomato. filter out genetic stability of without a marker gene and efficient expression transgenic plant. By oral immunization of animal with Fusion proteins of transgenic tomato expressing to evaluate inducting capacity of specific antibodies and inhibiting the dental caries, to survey induced the immune response of type and intensity, and detect the prevent caries ability of the vaccine. When this vaccine will be oral immune, it be to analysis cells in the mucosa - associated lymphoid tissue composition, expression of cytokines, number of specific B - lymphocytes and memory B lymphocytes by immunofluorescence、confocal laser technologies and flow cytometry for methods, to investigate on mucosal immune anti-caries effects and its possible mechanism of this vaccine, in order to transgenic plant oral anti-caries vaccine of research and development provides new thought and means.

变异链球菌（简称变链菌）是主要致龋菌，表面蛋白和葡糖基转移酶（GTF）是变链菌致病的主要毒力因子。本研究拟克隆富含T、B淋巴细胞表位的变链菌表面蛋白粘附相关肽段和GTF催化功能区基因，克隆佐剂CTB 和靶向蛋白DOCK8核心功能区基因，经添加植物信号肽、内质网靶向序列和柔性肽等基因修饰后，插入携带番茄果实特异性启动子的植物表达载体中，构建稳定高效的转基因植物表达质粒并转化番茄，筛选出不带标记基因、遗传稳定、表达高效的转基因植株。检测转基因番茄表达的融合蛋白口服免疫动物诱导特异性抗体和抑制龋病的能力、诱导的免疫反应类型与强度，评价该疫苗的防龋能力。以免疫荧光、激光共聚焦、流式细胞检测等技术分析该疫苗口服免疫后黏膜相关淋巴组织中的细胞组成、细胞因子的表达、特异性B淋巴细胞和记忆性B淋巴细胞的数量，探讨该疫苗的口服免疫防龋效果及可能机制，为转基因植物口服防龋疫苗的研究和开发提供新的思路和手段。

龋病是人类最常见的口腔疾病之一，严重威胁着人群的口腔健康。目前在我国龋病的发生率有上升趋势，因此找出控制龋病的有效措施仍是当前的紧迫任务。但龋病又是一种非致死性疾病，必须充分考虑到其制剂高效、安全、价廉物美，预防接种的方法易于被人群接受。转基因植物疫苗具有成本低廉、运输与保存容易，可口服接种，免除了打针带来的经济负担和疼痛，显示出了巨大的潜力和应用前景，并得到了世界卫生组织的提倡。 变异链球菌（简称变链菌）是主要致龋菌，表面蛋白和葡糖基转移酶（GTF）是变链菌致病的主要毒力因子。本研究拟克隆富含T、B细胞抗原决定簇的变链菌表面蛋白粘附相关肽段PacA和GTF的催化功能区（CAT）编码基因，克隆佐剂CTB 和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，将上述基因嵌合在同一个植物表达载体，利用番茄果实特异性启动子E8启动融合蛋白的表达，构建稳定高效的转基因番茄表达质粒，转化番茄植株后，检测转基因番茄表达的融合蛋白口服免疫动物诱导特异性抗体和抑制龋病的能力，为转基因植物口服防龋疫苗的研究和开发提供新的思路和手段。研究成果包括获得了可用于植物遗传转化的不含Km和GUS选择标记基因的融合基因表达载体，该载体含有果实特异性启动子E8，APB中包含cat、PacA和ctxB基因，以及胞质分裂专一蛋白8（DOCK8）；将外源目的基因导入番茄外植体，获得不带标记基因的转基因植株，PCR扩增、GUS染色证实变异链球菌表面蛋白A区、葡糖基转移酶催化功能区、霍乱毒素B亚单的融合基因以及DOCK8的核心功能区已成功整合到番茄植物基因组中；Western印迹和ELISA法证实目的基因能在转化的番茄植株果实中有效表达，并筛选到高效表达目的蛋白在转基因番茄植株，成功制备抗PAcA多克隆抗体；口服免疫SD大鼠后观察到在唾液和血液中均产生特异性抗体，并能在一定程度上减少龋齿的发生，证明转基因番茄作为口服疫苗具有较好的免疫原性，能诱导实验动物黏膜免疫和全身免疫反应。