硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）结合肽联合激动型L1抗体治疗脊髓损伤实验研究

Spinal cord injury is a detrimentally clinical setting due to the difficult neuronal regeneration as a large medical challenge. The lackness of beneficial molecules and the accumulation of regeneration inhibition molecules chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs) severely abrogate the functional recovery post injury. The data available from our experiments demonstrated that administration of stimulatory domain antibody targeting cell adhesion molecule L1 can effectively promote the elongation of neuronal axons into the glial scar, while unsuccessful crossing to the site distal to the injury was observed. Thus, inhibiton of CSPGs function by neutralizing the functional epitope of CSPGs may stimulate a series of signaling cascades related to neuronal regeneration, thus representing a key step of structural reconstruction and functional recovery after spinal cord injury. In the present project, we purposed to apply phage display (PD) to screen the specific binding peptide for CSPGs with a strong biological activity. Then, PCR, Western blot (WB)， immunohistochemistry (IHC)， immunofluorescence (IF), and behavioral methods were employed to study the single use of the binding peptide, or the combinatorial application of binding peptide and stimulatory antibody targeting the cell adhesion molecule L1, on post-injury neuronal regeneration, glial scar formation, as well as on motion improvement. Through these experimentl designs, we hope to establish a therapeutic regimen composed of stimulating neuronal regeneration and neutralizing regeneration inhibition molecules. This project may provide a valuable clue for clinical management of spinal cord injury.

脊髓损伤后神经元再生是巨大的医学难题。损伤部位胶质瘢痕中有益分子相对匮乏，而修复抑制分子如硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）严重阻碍损伤后功能恢复。我们已有研究结果表明小鼠脊髓损伤后给予激动型细胞黏附分子L1抗体可有效促进神经元轴突延伸进入胶质瘢痕，但不能有效穿越损伤断端。封闭CSPGs功能位点，抑制CSPGs作用，进一步激活一系列与损伤修复有关的信号级联反应，可能成为促进脊髓损伤后结构重建和功能恢复的重要环节。本课题拟首先通过噬菌体展示技术筛选具有生物活性的CSPGs特异性结合肽，并综合使用细胞生物学、分子生物学、形态学以及行为学等实验方法，观察单独使用结合肽以及结合肽与激动型细胞黏附分子L1抗体联用对脊髓损伤小鼠神经再生、胶质瘢痕以及运动功能改善的影响，确立以促进轴突再生和中和修复抑制因子为主导的脊髓损伤联合治疗方案，为临床应用提供有益参考。

脊髓损伤(SCI)后神经元再生是巨大的医学难题。神经细胞粘附分子L1 (L1CAM)是有助于神经修复的重要分子,而损伤部位胶质瘢痕中有益分子相对匮乏，且修复抑制分子如硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）严重阻碍损伤后功能恢复。小鼠脊髓损伤后给予激动型L1抗体H2-1可有效促进神经元轴突延伸进入胶质瘢痕，但不能有效穿越损伤断端。封闭CSPGs功能位点，抑制CSPGs作用，进一步激活一系列与损伤修复有关的信号级联反应，可能成为促进脊髓损伤修复的重要环节。本课题首先通过噬菌体展示技术筛选具有生物活性的CSPGs特异性结合肽，并综合使用细胞生物学、分子生物学、形态学以及行为学等实验方法，观察单独使用结合肽以及结合肽与H2-1抗体联用对脊髓损伤小鼠神经再生、胶质瘢痕以及运动功能改善的影响。. 研究结果表明，相比损伤组，H2-1组损伤中心区CSPGs水平减少。H2-1可能改变SCI后CSPGs相关蛋白如Aggrecan、RGMa及Lingo-1水平与分布，使其向有利于神经轴突再生方向转化。我们从筛选到的多个与C4S结合的噬菌体克隆中选择了3个克隆，得到其氨基酸序列，合成多肽，并做进一步的功能分析。研究表明这些肽可与C4S结合,并中和C4S或CSPGs对小鼠小脑颗粒细胞黏附和轴突生长以及人神经母细胞瘤细胞迁移的抑制作用，提示C4S结合肽可中和CSPGs的多种抑制作用，有助于修复哺乳动物神经系统损伤。. SCI后，损伤脊髓明显变细，而单独或联合给药，则损伤脊髓与给药组相比略增粗。单独及联合给药均可减小损伤核心区宽度，以结合肽TR给药组为著。单独以及联合给药可显著降低胶质瘢痕处GFAP荧光强度，Iba-1水平仅在TR给药组有降低。BMS评分研究结果表明，与SCI组相比，各给药组运动功能均有改善，以TR组最为明显，而联合给药后评分介于H2-1与TR组评分之间，因此联合给药的时间点和作用机制有待进一步探讨。. 本课题实施中，我们将离体细胞模型和动物实验相结合，有助于对脊髓损伤发病和药物治疗机制进行综合深入的探讨，这也将成为未来我们实施其他神经再生相关课题的范例。