激动型神经细胞粘附分子L1抗体治疗小鼠脊髓损伤实验研究

脊髓损伤后神经元再生是巨大的医学难题。在成年患者中，损伤部位有益分子相对匮乏，而修复抑制分子则相对丰富，阻碍了损伤后功能恢复。神经细胞粘附分子L1是有助于神经修复的重要分子,在神经系统发生发育、轴突可塑性及损伤后神经再生中发挥重要作用。因此，激活脊髓损伤部位L1，进而启动一系列与损伤修复有关的信号级联反应，可能成为促进脊髓损伤后结构重建和功能恢复的重要环节。本课题拟用易错PCR、亲和熟化法首先对已有L1抗体进行功能优化，并通过小鼠脊髓损伤动物模型、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹（Western blotting）、行为学等实验方法，以及人干细胞诱导神经元模拟离体脊髓损伤，观察优化的单克隆L1抗体Fab段在轴突生长、神经元再生和轴突可塑性以及神经系统损伤后神经再生中的作用,从而为深入了解激动型L1抗体治疗脊髓损伤提供依据，并进一步为其在脊髓损伤中的临床应用打下基础。

脊髓损伤(SCI)后神经元再生是巨大的医学难题。神经细胞粘附分子L1 (L1CAM)是有助于神经修复的重要分子,在神经系统发生发育、轴突可塑性及损伤后神经再生中发挥重要作用。本课题旨在通过噬菌体展示技术筛选激动型人源L1CAM结构域抗体,并通过体外细胞实验和脊髓损伤动物模型观察其对神经来源细胞信号通路、神经突生长以及运动功能改善的影响。使用噬菌体展示技术成功地筛选并纯化了一个激动型L1CAM的结构域抗体，该抗体可与内源性L1分子结合，且具有较好的亲和力。分子量为14 kDa,不足抗体Fab段的1/5，单链可变区抗体（scFv）的1/2,故理论上更有利于通过小鼠脊髓组织的血脑屏障。使用人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）、小鼠原代培养小脑颗粒神经元（mCGNs）以及人源神经干细胞（hNSC）和神经前体细胞(HCN-2)研究发现,该结构域抗体可促进SK-N-SH细胞的聚集，突起伸展，mCGNs神经突生长，促进经诱导后的hNSC细胞长出较长且面积较大的生长锥，且可促进HCN2细胞分化为神经元。这些作用可能与抗体激活Akt1和Erk相关信号有关。于小鼠脊髓损伤后给予尾静脉注射该结构域抗体（10 μg•kg-1•d-1）,共7d,可一定程度上改善小鼠SCI后BMS (Basso Mouse Scale score)评分。分子生化及形态学研究表明,激动型L1结构域抗体改善小鼠脊髓损伤可能与其在损伤不同阶段促进神经再生相关分子mTor和Bcl-2，以及抑制不利于损伤后修复的分子PTEN、GFAP和Bax表达，同时减轻炎性反应等有关，且这些作用可能是通过激活Erk1/2和Akt1信号通路实现的。脊髓损伤后，损伤核心区细胞成分十分复杂，包括胶质细胞和纤维母细胞增生，炎性细胞浸润等，成为在体研究脊髓损伤信号通路的难点。在本课题实施中，我们将离体细胞模型和动物实验相结合，有助于对脊髓损伤发病和药物治疗机制进行综合深入的探讨，这也将成为我们实施其他课题的范例。