基于转录组学的铜绿假单胞菌利用甘油厌氧合成鼠李糖脂机理研究

Efficient in-situ production of biosurfactants such as rhamnolipids in oil reservoirs by microorganisms is one of the keys to successful microbial enhanced oil recovery (MEOR) technology. Considering the anoxic or anaerobic conditions within subsurface oil reservoirs, improving the in-situ production of rhamnolipids is of great importance. A few studies have discovered that, although some Pseudomonas aeruginosa strains can grow under anaerobic conditions using either glycerol or glucose as sole carbon source, the anaerobic synthesis of rhamnolipids is achieved only when glycerol is used as carbon source. At present, the anaerobic yield of rhamnolipids is quite low, and the related mechanisms are unclear. In this project, we will compare the differences in gene expression of strain P. aeruginosa SG, isolated from an oil reservoir by the proposer, when grows anaerobically with glycerol or glucose, and aerobically with glucose as sole carbon source, based on the transcriptome analysis. Moreover, using the integrated method of gene knock-out, RT-qPCR and RNA interference, we aim to identify the key genes and the pathway of rhamnolipids anaerobic synthesis by P. aeruginosa SG using glycerol, and to reveal the underlying mechanism. The results obtained would fill the gaps in the mechanism of rhamnolipids anaerobic synthesis and lay theoretical foundations for the development of high-yield rhamnolipids-producing bacteria under anaerobic conditions, and for the application of enhancing oil recovery technology based on in-situ production of rhamnolipids within anoxic/anaerobic oil reservoirs.

微生物在油藏中高效产生鼠李糖脂等表面活性剂是微生物采油技术取得成效的关键之一。针对油藏的缺/厌氧环境，提高微生物在油藏原位的鼠李糖脂产量对于微生物采油技术的发展具有重要意义。研究发现一些铜绿假单胞菌在甘油和葡萄糖两种碳源下均可以厌氧生长，但只利用甘油厌氧合成鼠李糖脂，且厌氧产量较低，机理尚不清楚。本项目以申请人筛选的铜绿假单胞菌菌株SG为研究对象，通过转录组测序技术解析其在不同碳源、不同氧气条件下（甘油厌氧、葡萄糖厌氧和葡萄糖好氧）的基因表达差异；结合基因敲除方法、RT-qPCR方法和RNA干扰技术，明确参与代谢甘油厌氧合成鼠李糖脂过程的关键基因，探讨利用甘油厌氧合成鼠李糖脂的代谢途径。通过关键基因挖掘和代谢途径探索，阐明铜绿假单胞菌利用甘油厌氧合成鼠李糖脂的机理。本研究结果将填补鼠李糖脂厌氧合成机理研究的空白，并为厌氧高产鼠李糖脂菌剂的研发及油藏原位产鼠李糖脂驱油技术的应用奠定理论基础。

鼠李糖脂是当前研究和应用最热门的生物表面活性剂。微生物在油藏中高效产生鼠李糖脂等表面活性剂是微生物采油技术取得成效的关键之一。针对油藏的缺/厌氧环境，解析鼠李糖脂的厌氧生物合成机理，提高微生物在油藏原位的鼠李糖脂产量对于微生物采油技术的发展具有重要意义。前期研究发现Pseudomonas aeruginosa SG可以利用甘油厌氧合成鼠李糖脂，且厌氧产量较低，机理尚不清楚。本研究通过敲除菌株SG的鼠李糖合成操纵子rmlBDAC，发现rmlBDAC是菌株SG代谢甘油厌氧合成鼠李糖的必需基因之一，同时推翻本项目的研究假设1。比较分析菌株SG在不同氧气和碳源条件（厌氧甘油、厌氧葡萄糖、好氧葡萄糖）下的转录组，明确了P. aeruginosa SG代谢甘油厌氧合成鼠李糖脂的关键基因，并构建了菌株SG利用甘油厌氧合成鼠李糖脂的代谢途径。在厌氧条件下，葡萄糖抑制了鼠李糖脂合成关键基因的表达，以甘油为碳源恰好又上调了这些基因的厌氧表达，使得P. aeruginosa SG能够利用甘油厌氧产生鼠李糖脂，验证了本项目的研究假设2，在基因水平上揭示了铜绿假单胞菌利用甘油厌氧合成鼠李糖脂的生物学机理。比较铜绿假单胞菌SG利用甘油在好氧和厌氧条件下的鼠李糖脂产物，首次发现厌氧合成产物因含有较高比例的单鼠李糖脂而具有更好的原油乳化活性。研究不同P. aeruginosa菌株的鼠李糖脂厌氧合成，发现不是P. aeruginosa菌株SG的特异性，而是甘油这一特定底物的代谢作用促使P. aeruginosa厌氧合成鼠李糖脂。在本研究基础上，以甘油为碳源定向强化油藏本源P. aeruginosa原位厌氧产鼠李糖脂可有效提高原油采收率。本研究结果填补了鼠李糖脂厌氧合成机理研究的空白，对于指导并推动鼠李糖脂厌氧合成的相关研究与应用具有重要意义。