基于患者特异性iPSC分化的肺泡上皮细胞探讨特发性肺纤维化EMT-MET双向调控的分子机制

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic disease with unknown pathogenesis and poor treatment. However, most of the conclusions on IPF are from animal models and could not elucidate the truth of human IPF. In our early research, it was found that there exist EMT-MET (epithelial mesenchymal transition-mesenchymal epithelial transition) bi-directional regulation in alveolar epithelial cells of both IPF patients and non-IPF patients. However there is no MET happened after EMT and removal of the induced factors in alveolar epithelial cells of IPF patients. This conclusion may be an important pathogenesis of IPF. Because it is so difficult to get enough human lung samples, we could not do more deep research on this area. In this research, we will use somatic cell reprogramming and induced pluripotent stem cell (iPSC) technology, ① to prepare alveolar epithelial cells from iPSC of both IPF and non-IPF patients; ② to confirm EMT-MET bi-directional regulation in alveolar epithelial cells of both IPF and non-IPF patients and MET blockade in IPF patients; ③ to observe the effect of TGF-βsignal passway in MET blockade of alveolar epithelial cells in IPF patients; ④ to screen the “key signal pathway” in MET in alveolar epithelial cells of both IPF and non-IPF patients and to confirm the “key signal pathway” in MET in cultured human alveolar epithelial cells derived from both IPF lung samples and non-IPF patients lung samples. Based on this research, we will elucidate the molecular mechanics of EMT-MET bi-directional regulation and MET blockade in alveolar epithelial cells of IPF patients. It will be helpful to clarify the pathogenesis of IPF and provide a new target point of treatment to IPF.

特发性肺纤维化（IPF）是一种发病机制不明、治疗效果差的疾病。大量基于动物模型的研究结果并不能说明人IPF的本质。我们前期的研究结果表明：IPF及非IPF患者肺泡上皮细胞均存在上皮-间质细胞转化（EMT）和间质-上皮细胞转化（MET）双向调控，但IPF肺泡上皮细胞MET受阻。本项目拟采用体细胞重编程和诱导多能干细胞（iPSC）分化技术， ①制备IPF及非IPF特异性iPSC分化的肺泡上皮细胞；②观察非IPF肺泡上皮EMT-MET双向调控特征和IPF肺泡上皮MET受阻现象；③研究TGF-β信号通路在IPF肺泡上皮MET受阻中的作用；④筛选调控非IPF肺泡上皮MET发生和IPF肺泡上皮MET受阻的“关键信号通路” , 并在原代培养的IPF肺泡上皮细胞中验证此通路。通过本研究可阐明IPF肺泡上皮细胞EMT-MET双向调控及MET受阻的分子机制，为IPF的发病机制提供新的理论，寻找新的治疗靶点。

特发性肺纤维化（IPF）发病机制不明、缺乏有效治疗药物且预后极差。以往有关IPF的研究均采用动物细胞和模型,获得的实验结果在临床研究中多数都无法重复，提示IPF动物细胞及模型与临床患者具有本质差异，采用患者来源的肺泡上皮细胞进行IPF研究具有重要意义。我们前期研究发现：IPF及非IPF患者来源的肺泡上皮细胞在损伤后均可发生上皮-间质细胞转化（EMT），但非IPF患者的肺泡上皮细胞在损伤因素去除后可出现间质-上皮细胞转化（MET），而IPF患者的肺泡上皮细胞EMT为一不可逆过程，即MET过程受阻。项目拟采用体细胞重编程和诱导多能干细胞（iPSC）分化技术，制备IPF患者特异性iPSC分化肺泡上皮细胞模型、验证IPF肺泡上皮细胞MET受阻的机制。主要进行了以下实验研究:（1）建立优化了原代肺泡上皮细胞分离培养技术，通过支气管镜获取IPF患者及对照患者的肺组织标本，采用课题组建立的组织块法+人肺泡上皮特异培养基进行原代肺泡上皮细胞培养、免疫组化染色鉴定肺泡上皮细胞标志物表达阳性，体外可以连续传代3－4代仍可保持肺上皮细胞的特点;（2）利用肺切除手术临床标本分离培养了c-kit+细胞，并进行了诱导分化，发现人肺脏组织c-kit+细胞可以分化为血管内皮细胞，无法分化为肺泡细胞:（3）建立了利用IPF患者和非IPF患者外周血单核细胞重编程制备iPSC，并通过模拟肺发育过程的信号分子作用模式，将iPSCs诱导分化为肺泡上皮的方法;（4）进行了IPF及非IPF患者特异性iPSC分化的肺泡上皮细胞EMT-MET的比较，验证了IPF患者的肺泡上皮细在机械刺激或TGF-b刺激后可发生EMT，但去除损伤刺激因素MET受阻的现象;（5）进行了IPF患者肺泡上皮细胞MET受阻调控机制的探讨，发现与衰老相关的SIRT1通路功能障碍与MET受阻有密切关系，目前正进一步实验验证。项目建立的IPF患者iPSC制备及诱导分化肺泡上皮细胞的方法可能为未来深入研究IPF发生机制解决肺泡上皮细胞的来源问题；SIRT1信号通路调控IPF肺泡上皮MET受阻机制的发现若得到后续实验充分验证，将为IPF发病机制提供了新认识、为药物开发提供新靶点。