纤毛虫高rDNA拷贝数对其分子多样性评价的影响研究

With application of the 18S rDNA sequencing in microbial eukaryotes, a higher diversity of ciliate than other groups has been gradually discovered in marine. The extremely high molecular diversity largely exceeds that detected by the morphological methods. In comparison with other microbial eukaryotes, ciliates have higher copy number of rDNA which could lead to misestimate their molecular diversity. Thus, is the high molecular diversity of ciliate real or artifact resulted by the high rDNA copy number? To answer this question, we 1) investigate the copy number of rDNA in a single cell of ciliate and its relationship with the polymorphisms in 18S rDNA by the clone library and quantitative PCR; and 2) prepare the mock community with the ciliate species and other protists, compare the diversity of ciliate with different copy numbers of rDNA based on the high through-put sequencing and morphological study, and determine how the copy number influence the estimation of the molecular diversity of ciliate. The project will provide the base for understanding the true level of ciliate diversity in marine ecosystem.

近来对海洋尤其是深海的微型真核生物18S rDNA分子多样性研究表明，纤毛虫常是其中分子多样性最高的类群。这与纤毛虫的形态多样性检测结果相差悬殊。相较于其他微型真核生物，纤毛虫具有明显高的rDNA拷贝数，可能影响了对其18S rDNA分子多样性的准确评估。由此，纤毛虫高分子多样性是真实存在，还是由于其高rDNA拷贝数造成的假象，成为亟需解决的问题。本项目拟通过：1) 荧光定量PCR结合克隆文库测序，研究纤毛虫rDNA拷贝数与其个体内、个体间和种群间18S rDNA多态性的关系；2) 18S rDNA高通量测序技术结合准确的分类鉴定，通过对纤毛虫和其他原生生物模拟群落的分析，比较不同rDNA拷贝数的纤毛虫检获的序列数与OTU数/分子多样性的关系，阐明rDNA拷贝数对纤毛虫分子多样性评价的影响及机制。本研究将为准确评价纤毛虫多样性提供切实依据，为微型真核生物分子多样性研究与评价提供理论支撑。

纤毛虫是海洋中形态多样和功能重要的单细胞微型真核生物类群。近年来基于18S rDNA的分子技术在海洋尤其是深海中检获了极高的纤毛虫分子多样性，这与纤毛虫的形态多样性检测结果相差悬殊。相较于其他原生生物，纤毛虫的rDNA拷贝数明显高，可能导致其高分子多样性中存在误读。本项目结合荧光定量PCR技术以及单细胞和模拟群落高通量测序，科学评估纤毛虫SSU rDNA拷贝数及拷贝间序列变异对纤毛虫18S rDNA分子多样性研究的影响。荧光定量PCR测定的纤毛虫代表种SSU rDNA拷贝数均在10000以上，尤其是游仆虫两代表种的拷贝数均在100000以上。单细胞内SSU rDNA拷贝数越高，拷贝间序列差异越大。测定的纤毛虫SSU rDNA的V4 区个体间差异略大于个体内差异，整体上种内差异基本小于3%，种间差异基本大于3%。纤毛虫SSU rDNA拷贝间的序列差异程度与纤毛虫大核个数存在正相关关系，去除稀有序列或减少抽取序列数，拷贝间序列差异的最大值，变异位点数量和技术错误率显著降低。模拟群落的高通量测序结果表明纤毛虫SSU rDNA拷贝数与其检获的OTUs数和序列数不存在简单的线性相关关系，但是高SSU rDNA拷贝数有助于其在DNA提取和PCR过程中得以保存，并且导致单细胞内SSU rDNA高变异程度，增加了高估纤毛虫分子多样性的风险。DNA和RNA测序对分析结果影响不大，但RNA测序高估多样性的风险高于DNA测序。不同数据处理流程对分析结果影响大，USEARCH在97%序列相似度下的分析结果与真实群落最为相近。本项目为后续真核微生物，尤其是纤毛虫，分子多样性研究和OTUs的划分提供科学依据，为准确评价纤毛虫分子多样性搭建合理的技术体系。