印迹基因H19表达调控与孤雌胚胎干细胞多能性关系研究

我们的前期研究表明孤雌胚胎干细胞（pES）生殖系转移能力与正常胚胎干细胞（fES）类似，在四倍体互补试验中得到了pES四倍体新生儿，证明我们新建的pES细胞能发育成个体所有组织器官，但是pES后代出生后死亡，不能得到成活个体，这说明pES细胞发育潜能与fES细胞存在一定的差异，这将影响pES细胞在再生医学中的应用潜能。前期研究表明pES细胞中H19表达高于fES细胞，H19的高表达或许是造成无法得到pES成活个体的原因之一。在该研究中我们拟利用RNA干扰方法降低pES中母系来源印迹基因H19的表达，然后利用四倍体互补或4-8细胞注射方法检测H19表达下降的pES细胞多能性是否提高，是否能得到成活个体。此外我们还将采用microRNA芯片以及表达谱芯片的方法检测H19在pES细胞中的下游靶基因。从而深入了解H19在pES多能性及其胚胎早期发育中的作用机制。

胚胎干细胞具有多能性而且具有无限增殖能力和分化潜能。人的胚胎干细胞对于治疗退化性病变有很大帮助。但是人的胚胎干细胞研究充满了伦理道德方面的问题。孤雌胚胎干细胞是一种从激活的卵子中分离出来的多能性干细胞，没有破坏自然存在的胚胎,因而避免了很多伦理道德上的问题。孤雌胚胎以及孤雌胚胎干细胞没有发育上的全能性是因为它们的基因印迹不正常。H19是一个在胚胎发育过程中以及干细胞分化过程中高表达的印迹基因。H19的表达受到处于其基因上游的印迹调控区的控制。H19基因的功能目前还不是很清楚。H19基因敲除的小鼠是存活并可育的。而且如果在孤雌胚胎中敲除了H19，孤雌发育的时间能够进行的更长。更重要的是，如果结合了核移植技术以及H19基因敲除，就能得到没有精子参与其发育过程的小鼠，而且这种小鼠还能够正常繁殖后代。因此H19有可能在孤雌胚胎以及孤雌胚胎干细胞中行使着一定功能。. 我们首先比较了孤雌胚胎干细胞与正常受精胚胎干细胞中H19的表达情况，H19在孤雌胚胎干细胞中的表达要高一些。接下来我们运用RNA干扰技术在孤雌胚胎干细胞中对H19表达进行干扰。在我们的实验中，降低H19表达并不影响孤雌胚胎干细胞的多能性以及自我更新的能力。我们又在体内和体外实验中对孤雌胚胎干细胞进行了分化。在体外分化实验中，降低H19表达后，细胞中出现心肌样跳动的比例增加，而且跳动频率也加快了，这与检测心肌相关基因表达上调的结果是相一致的。同时我们也发现体外实验中降低H19表达能够使得向表皮分化增加。体内的分化实验结果中，H19干扰的细胞形成的畸胎瘤要比正常的大。所以通过我们的研究我们发现降低H19表达有利于孤雌胚胎干细胞在体内以及体外的分化，尤其是促进向心肌和表皮的分化。该课题的开展推动了孤雌胚胎干细胞从实验室研究走向临床应用。