利用条件基因敲除研究Nestin对神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制

巢蛋白（Nestin）是一种重要的神经干细胞标志，同时发现其还在毛囊、新生血管、部分肿瘤中高表达，但目前对其生物学功能还知之甚少。申请人利用Nestin基因敲除的小鼠模型，发现Nestin纯合子小鼠在胚胎10.5天左右死亡，神经管发育不良，神经干/祖细胞大量凋亡，证实Nestin在胚胎神经发育中发挥了重要作用。但胚胎早期(E10.5)致死限制了对Nestin在干细胞增殖分化作用机制的深入研究。本研究拟在前期工作基础上，建立Nestin条件基因敲除小鼠模型，在神经发育不同阶段阶段灭活Nestin基因，在整体、细胞、分子水平观察nestin缺失对组织器官形成、发育、功能的影响，重点关注Nestin 与神经干/祖细胞增殖、分化、凋亡、迁移的关系。通过以上研究，不仅有助于阐明Nestin在神经发育过程中的作用机制，也为探讨其在其它组织器官（如毛囊、新生血管等）干/祖细胞中的作用机制奠定坚实的基础。

本研究利用Nestin-GFP转基因小鼠和Nestin条件基因敲除小鼠模型，在整体、细胞、分子水平观察Nestin缺失对组织器官形成、发育、功能的影响，重点关注Nestin 与神经干/祖细胞增殖、分化、凋亡、迁移的关系。.利用Nestin-GFP小鼠系统分析了nestin在各脏器的表达规律与特点；流式细胞技术分离了肾脏和睾丸组织GFP阳性细胞，研究显示nestin阳性细胞具有肾小球干细胞和睾丸leydig干细胞的特征，具有自我更新与多向分化能力；体内实验显示nestin阳性细胞具有再生病损组织的能力。提示nestin阳性细胞可能是成体组织干细胞的共同标志，为进一步研究成体组织干细胞的发育起源、组织再生修复的机制提供了重要依据。.首次发现了血管发育障碍可能是Nestin缺失引起胚胎死亡的主要原因。Nestin基因敲除纯合子小鼠在E10.5时胚胎发育迟滞，胚胎与卵黄囊苍白，部分胚胎出现心包积液；E11.5天时大部分纯合子胚胎已死亡，并出现不同程度的吸收。染色发现E10.5天血管分支减少，结构紊乱；E11.5天血管结构崩解，管腔粗大。纯合子E10.5天凋亡的细胞全部为血管周细胞，在E11.5天时，内皮细胞也逐渐凋亡。提示Nestin缺失可能会造成周细胞的凋亡增加。.利用RMCE技术，获得了Nestin条件敲除小鼠模型（Nestinfl/fl）。与Nestin Cre-ERT2小鼠交配，在E7-8天单次怀孕母鼠腹腔注射tamoxifen，发现注射后发现Nestinfl/fl（Nestin Cre-ERT2）仍然在E10.5-E11.5天死亡，表现为胚胎苍白，卵黄囊血管结构崩解，管腔粗大。在E12.5天后给予tamoxifen后，小鼠可存活，提示Nestin在卵黄囊血管结构维持中的重要性，进一步发现神经干细胞层明显变薄，神经干细胞凋亡增加。体外细胞学实验发现，神经干细胞胞内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平明显增加，抑制活性氧产生可显著提高神经干细胞的成活率，提示nestin缺失引起的ROS变化可能是引起细胞死亡的主要原因。