高活性高耐受性单加氧酶的筛选及其在手性亚砜类化合物中的合成应用

Chiral sulfoxids are one of the important biological active compounds and clincal pharmaceticals, and monooxygenase-catalyzed the asymmetric biooxidation of sulfides are one of novel access to synthesize sulfoxides compounds. Discovering and obtaining the highly active, selective and tolerative sulfide monoxygenases, which are applying for the synthesis of sulfoxide's pharmaceuticals. It still remains a challengen and bottle neck in the development of biooxidation. Baesd on our research foundation, Pseudomonas spicies EB-1 was used as an efficient biocatalyst for synthesis of enantiopure benzyl methyl sulfoxides with high yield at high substrate concentration. The key point of this project is to screen and isolate the sulfide monooxygenase-producing strains with high selectivity, enantioselectivity and tolerance by multi-step enriching culture method, and the topsoil and activated sludge samples will be collected from southwest of china with aboundunt natural resources. Moreover, the library of sulfide monooxygenases producing strains with high activity, selectivity and tolerance will be created, and the novel target sulfides will be investigated by the asymmetric oxidation for directly synthesis of serials sulfoxide's pharmaceuticals. More importantly, to study the asymmetric oxidation catalyzed by the sulfide monooxygenase with high acitivity，which is a valuable and significant work for asymmetric synthesis of optical active sulfoxides, slectivity and tolerance. This project will expand the further research of sulfide monooxygenase-catalyzed asymmetric biooxidation in organic synthesis.

手性亚砜是一类重要的生物活性物质和临床药物，而单加氧酶催化硫醚底物的不对称氧化反应，是合成亚砜类化合物的新途径之一。高活性、高选择性和高底物耐受性硫醚单加氧酶产生菌株的发现与获得，及其在亚砜类药物中的合成应用，仍然是生物氧化反应发展过程中的难点和瓶颈。据前期研究工作发现，Pseudomonas spicies EB-1能在高底物浓度下，催化合成高产率和对映纯的苯甲亚砜。本项目研究的重点是从自然资源丰富的西南地区选取独特的土壤和活性污泥样本，采用多次富集培养和分离，构建高活性、高选择性和高底物耐受性的硫醚单加氧酶产生菌株库，并应用到系列目标硫醚底物的不对称氧化反应之中，实现直接通过生物氧化反应一步合成系列亚砜类药物。研究高活性、高选择性、高耐受性硫醚单加氧酶催化的不对称氧化反应，对光学活性亚砜类化合物的不对称合成具有重要意义。本项工作将继续拓展生物催化不对称氧化反应在有机合成中的深入研究。

生物催化是不对称合成的新兴研究领域之一。本项目研究的重点是多次富集培养和分离筛选出具有产高活性氧化酶的微生物菌株，并应用到系列硫醚底物的不对称氧化反应之中，合成手性亚砜类化合物。通过研究发现：（1）筛选到Pseudomonas monteilii CCTCC M2013683能有效的催化芳香硫醚的不对称氧化反应，获得54%-99%的产率和63%-99% e.e.值的R构型手性亚砜产物；（2）P. plecoglossicida ZMU-T06可以有效催化4-二氢色原酮的不对称还原反应，分别获得87%-97%的产率和65%-87% e.e.值的S构型手性醇产物。（3）通过转录组比对，M2013683-LB和M2013683-M9两个菌株分别检测到了4774和4776个基因表达；基因功能聚类分析显示其中有1038个基因的表达有显著差异；有133个差异表达基因富集于“氧化还原酶活性（GO: 0016491）”功能组；（4）通过筛选发现Pseudomonas monteilii ZMU-T04菌株对模版底物1-(4-氯苯硫基)-2-丙酮具有较高的还原活性，底物转化率大于99%，产物(S)-1-(4-氯苯硫基)-2-丙醇的ee值大于99%。在此基础上，扩展了17个类似结构的底物，获得的β-羟基硫醚类化合物的ee值为92-99%。以(S)-1-(4-氯苯硫基)-2-丙醇为模版底物，发现在以四异丙氧基钛和(S)-BINOL的配合物作为催化剂、获得以高达99:1的dr值和>99%的ee值得到双手性中心的 (Ss,Sc)-1-(4-氯苯基亚砜)-2-丙醇产物。共合成得到了18个具有双手性中心β-羟基亚砜类化合物，dr值和ee值分别高达99:1和99%，并对反应机理进行了验证。（5）通过克隆的基因工程菌意外发现蛋氨酸亚砜还原酶能有效的对消旋的亚砜进行选择性的还原，获得手性亚砜和硫醚化合物。（6）筛选得到的Pseudomonas monteilii ZMU-T17可以有效催化3-烯基氧化吲哚类化合物3位C=C键的还原反应，获得最高产率达到82 %的3-取代氧化吲哚类化合物。通过对所筛选获得假单胞菌所含有的氧化酶和还原酶的研究，进一步探索了所筛选菌株的功能和酶的组成，实现了系列目标底物生物催化的不对称氧化还原反应。