四氢喹啉羟化酶基因工程菌的构建与改造及其在组合催化中的应用研究

Hydroxylase-catalyzed asymmetric hydroxylation reaction was one of important access to synthesize chiral sec-alcohols. Usually, it has several distinguishing features such as high selectivity and environmental-friendly. At the same time, it is meaningful to design combinatorial catalytic method for synthesizing chiral sec-alcohols and its derivates with two chiral centers based on hydroxylase. Thus, we are going to know more detailed information based on Pseudomonas sp. ZMU-T02 in this project. The genetically engineered strain containing 1,2,3,4-tetrahydroquinoline hydroxylase will be constructed by analysis of target genes based on transcriptome dataset, and it will be further modified by directed evolution. In addition, enantiocomplimentary 1,2,3,4-tetrahydroquinoline hydroxylase mutants with high activity and stereoselectivity will also be obtained by based high-throughput methods. Meanwhile, the combinatorial catalytic reaction system with asymmetric transfer hydrogenation and hydroxylation will be constructed in one-pot based on metal Rh complex and hydroxylase, each isomer of 2-substituted-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-4-ols will be directly synthesized by this designed reaction system, respectively. For the mutants with high activity and stereoselectivity, the relationships of active-site of enzyme and substrate structure will also be investigated. This challenging project will further explore the application of biohydroxylation reaction in organic synthesis, and it is an important supplement for asymmetric synthesis.

羟化酶催化的不对称羟基化反应是合成手性醇类化合物的重要途径之一，通常具有选择性高、环境友好等特点。同时，围绕羟化酶设计和构建组合催化方法合成具有双手性中心的手性醇类化合物具有重要意义。因此，本项目是基于前期研究发现的假单胞菌ZMU-T02进行更深入的研究，利用转录组数据分析目的基因，构建四氢喹啉羟化酶的工程菌，并通过定向进化技术改造酶，采用已建立的高通量筛选方法，获得立体选择性互补的四氢喹啉羟化酶突变体。同时，基于金属铑催化剂和羟化酶构建“不对称转移氢化/羟基化”的组合催化反应体系，通过“一锅”串联反应直接实现具有双手性中心的2-取代四氢喹啉-4-醇类化合物四个异构体的设计性合成。此外，对高活性和高立体选择性的四氢喹啉羟化酶突变体，研究其催化活性位点与底物结构之间的关系。本项目将进一步拓展生物催化不对称羟基化反应在有机合成中的深入研究，具有一定的挑战性，对丰富不对称合成方法学具有重要意义。

单加氧酶催化C-H键的不对称羟基化反应是制药领域中挑战性的研究领域。本项目主要完成了以下研究工作：(1)研究了以金属铑-络合物为催化剂，2-取代喹啉类底物为原料，在水相反应体系中通过不对称转移氢化反应合成R构型2-取代1,2,3,4-四氢喹啉。接着直接通过不对称羟基化反应合成具有双手性中心的2-取代四氢喹啉-4-醇类化合物，探索“不对称转移氢化-羟基化”的水相反应体系；(2)分别构建了3类四氢喹啉羟化酶、P450单加氧酶和单胺氧化酶的基因工程菌。摸索和优化重组蛋白诱导的表达条件，以不同的模板底物进行重组酶催化活性、对映选择性和非对映选择性筛选，合成相应的手性药物活性分子及其关键中间体；(3)成功克隆表达了P450酶基因与辅蛋白Fdr-Fdx基因，通过共表达获得P450酶，完成了P450酶及电子传递系统的构建;（4）设计了2套基于双酶体系的P450单加氧酶的高通量筛选方法，一是基于P450酶与卤醇脱卤酶的级联反应，建立一种氯离子含量比色检测的单加氧酶的高通量分析方法。二是基于脂肪酶能够高特异性水解苯乙酸甲酯和不对称羟化产物扁桃酸甲酯，建立了一种可用于P450酶催化苯乙酸甲酯不对称羟化活性分析的单加氧酶的高通量方法；（5）经过随机突变和迭代饱和突变，筛选得到活性最佳P450DA突变体，其催化苯乙酸甲酯合成S构型扁桃酸甲酯产率相对于野生型提高32.3倍，可获得具有97%产率和99%的ee值S构型扁桃酸甲酯。突变体对1-氯-2-苯乙烷苄位羟化反应的催化活性较野生型P450DA提升了13倍，产物的2-氯-1-苯乙醇的产率与ee值分别为91%和80%。项目的研究对不断挖掘野生菌株内新酶的组成，探索酶的性质，拓展不对称氧化反应在有机合成中的合成应用，以及对手性药物的绿色催化合成具有重要意义。