新型羟化酶的高通量筛选及在苄位不对称羟基化反应中的应用研究

羟化酶催化的不对称羟基化反应,是合成手性醇类化合物的新途径之一，它通常具有选择性高、环境友好等特点。本项目研究的重点是从自然资源丰富的西南地区选取独特的土壤和河床污泥样本，以系列芳香烷烃衍生物作为唯一碳源，采用多次富集培养和分离筛选出具有产高活性羟化酶的微生物菌株。通过已建立的快速和准确的关于羟化酶的高通量筛选方法作为研究基础，筛选和构建立体选择性互补的产羟化酶的微生物酶库，尤其是寻求S-选择性的羟化酶，并应用于系列含有功能基团新结构目标底物苄位的不对称羟基化反应之中，并以此反应作为关键一步，设计合成系列醇类的手性药物。与此同时，对高活性和高选择性的产羟化酶的微生物菌株，将研究其酶学性质与功能。通过羟化酶催化直接活化含有功能基团化合物苄位亚甲基的C-H键，对光学活性醇类化合物的不对称合成具有重要意义，具有一定的挑战性。本项工作将拓展生物催化不对称羟基化反应在有机合成中的深入研究。

1. 项目的背景：生物催化是不对称合成的新兴研究领域之一， 生物催化的不对称羟基化反应是生物氧化反应中的难点和挑战性的研究领域。.2. 研究内容：本项目研究的重点是从自然资源丰富的西南地区选取独特的土壤和污泥样本，以系列芳香烷烃衍生物作为唯一碳源，采用多次富集培养和分离筛选出具有产高活性羟化酶的微生物菌株。通过课题组已建立的快速和准确的羟化酶的高通量筛选方法作为研究基础，筛选和构建高立体选择性的产羟化酶的微生物酶库，并应用到系列含有功能基团新结构目标底物苄位的不对称羟基化反应之中，通过羟化酶催化直接活化含有功能基团化合物苄位亚甲基的C-H 键，合成一些含有特殊功能基团的手性醇类化合物。.3. 重要结果和关键数据：（1）筛选到具有较高立体选择性和区域选择性的单加氧酶产生菌株Pseudomonas sp. ZMU-T02和Pseudomonas sp. ZMU-T06可分别对1,2,3,4-四氢喹啉和四氢苯并氮杂卓-1H-苯并[b]氮杂卓苄位C-H键进行选择性不对称羟基化反应，分别得到82%的产率及99%的ee值和99%的产率及98%的ee值。（2）以脂肪酶为催化剂，氯乙酸乙烯酯为高效的酰基供体，催化消旋的1,2,3,4-四氢喹啉-4-醇类化合物和2,3,4,5-四氢苯并氮杂卓-1H-苯并[b]氮杂卓-5-醇类化合物的不对称酰基化反应，实现高对映选择性拆分合成（>99% ee）。(3) 实现了仲胺的直接氧化反应合成酰胺的绿色合成方法；（4）利用假单胞菌ZMU-T01整细胞生物氧化拆分消旋的2-取代四氢喹啉类化合物获得高对映选择性和高光学活性的2-取代的四氢喹啉类衍生物，其转化率达到50%和ee值大于90%。.4. 科学意义：通过羟化酶催化活化C-H 键直接合成手性醇类化合物能有效的弥补和丰富不对称合成方法学。生物催化的不对称羟基化反应可望在发展成为工业化生产手性醇类药物及其中间体的新型生物氧化反应。