USP13调控MITF-M去泛素化参与獭兔黑色素生成的作用机制研究

Microphthalmia associated transcription factor M (MITF-M) plays an important role in the melanogenesis of animal’s skin and hair. MITF can be regulated by the post-translational modification. Based on the previous researches, deubiquitinase USP13 is involved in melanin deposition of Rex rabbits, and can regulate transcription of MITF-M target genes in melanogenesis pathway. Accordingly, we propose a hypothesis that MITF-M regulates the expression of its target genes via USP13-mediated deubiquitination and influences the melanogenesis in rabbit melanocytes. In order to verify our hypothesis, the melanogenesis and proliferation of rabbit melanocytes will be detected after overexpression and RNA interference of USP13. The interactions and deubiquitination patterns between MITF-M and USP13 will be identified using immunoprecipitation and Western blot. To investigate the mechanism of MITF-M regulating the melanogenesis via deubiquitination, the transcription of MITF-M target genes regulated by USP13 will be analyzed using ChIP and EMSA. The results will develop the research on related signal transduction pathways of melanogenesis from the post-translational modifications in fur animals.

小眼畸形相关转录因子-M型（MITF-M）在动物皮肤和毛发的黑色素合成途径中发挥了重要作用，其表达往往受蛋白质翻译后修饰调控。前期研究工作中，我们发现去泛素化酶USP13直接参与到獭兔黑色素沉积过程，且其表达变化影响了MITF-M靶基因的转录。据此，我们提出了USP13介导MITF-M的去泛素化，作用于MITF-M下游靶基因，进而影响黑色素细胞黑色素生成的假说。为验证这一假说，通过干扰和过表达USP13，分析USP13在黑色素细胞增殖和黑色素生成中的作用。结合免疫共沉淀和Western blot分析MITF-M与USP13的相互作用及去泛素化类型。利用ChIP和EMSA方法检测USP13对MITF-M下游靶基因转录的影响，探究MITF-M去泛素化修饰在黑色素生成中作用以及下游调控机制。研究结果将从蛋白翻译后修饰角度，进一步拓展MITF-M基因在皮毛动物黑色素沉积的功能以及相关信号转导途径。

毛色不仅是皮毛动物的重要经济性状，也是家畜有效确定杂交组合及品种纯度的遗传标记之一，蕴含着重要的经济价值，已经成为近年来生物学领域新兴的研究热点。以彩色獭兔为研究模型，深入解析被毛色素沉积机理，将为毛色改造和新品种培育奠定理论基础。项目证实了USP13和MITF-M参与獭兔毛色的形成过程，利用RT-qPCR和Wes技术检测不同毛色獭兔皮肤中mRNA和蛋白表达水平呈现一定规律性，其中均是黑色獭兔皮肤中表达量最高，白色獭兔皮肤中表达量最低。间接免疫荧光实验证实MITF-M亚细胞定位于细胞核，USP13定位于细胞核和细胞质。通过CCK8和Annexin V-FITC/PI检测方法，发现USP13和MITF-M的过表达促进兔黑色素细胞的增殖，但抑制其凋亡，下游黑色素相关基因TYR、DCT、GPNMB、PMEL的mRNA水平升高，黑色素细胞合成黑色素含量增加。反之，USP13和MITF-M的敲低能显著抑制兔黑色素细胞增殖，促进其凋亡，并降低下游黑色素相关基因的mRNA水平，抑制黑色素细胞合成黑色素。项目进一步探究USP13对MITF-M蛋白的调控作用，构建了含有Myc和Flag标签的表达载体，通过Co-IP实验验证USP13与MITF-M外源性结合，外源性USP13增加显著上调了内源性MITF-M的蛋白水平，USP13的敲低则显著抑制MITF-M蛋白水平，但均不影响MITF-M的mRNA水平。为了深入解析USP13对MITF-M的蛋白稳定性的影响，利用环己酰亚胺（CHX）处理细胞，在共转后不同时间点检测MITF-M的蛋白表达量，发现USP13的上调减慢了MITF-M蛋白的降解进程，增加了MITF-M蛋白的半衰期，表明USP13可以稳定外源性MITF蛋白水平。研究结果拓展了MITF-M基因在兔黑色素生成中的功能以及相关信号转导途径，并进一步阐明了去泛素化酶USP13介导MITF-M基因调控黑色素沉积机理，从蛋白质翻译后修饰角度拓展了皮毛动物黑色素生成信号通路，也将为皮毛动物的毛色改造和新型毛色品种培育提供理论依据。