CXCL12-CXCR4信号通路在新生鼠耳蜗听觉传入回路发育中的作用机制研究

Auditory afferent rehabilitation is the aim of inner ear stem cell study. We have found that transplanted stem cells migrated directionally into cochlear nucleus and auditory nerve in augmented acoustic environment. There were highly expressed CXCL12 where the implanted stem cells gathered in the cochlea.Sound of different intensity altered CXCL12 express in the cochlea. Sound stimulation is necessary for the inner ear maturaion, meanwhile CXCL12-CXCR4 pathway is a common molecular mechanism in migration, differentiation and maturation of vertebrates' neural stem cells. However, none research in the effect of sound stimulation and CXCL12-CXCR4 pathway on the development of cochlea in the newborn mice has been reported. In this study we will observe the spatiotemporal expression of CXCL12-CXCR4 in the cochlea of mice during postnatal development in normal breeding, augmented acoustic environment and air-conduction deprivation. We will evaluate the influence of CXCL12 signal on the neurite outgrowth, refinement and retraction, synapses and hearing function establishment in the developing mouse cochlea. This study will help us to clarify the molecular mechanisms of auditory circuit assembly and identify a regulation valve for stem cell restoration in cochlea.

内耳干细胞研究的目标是重建听觉传入神经回路。我们前期研究发现增强声刺激可以诱导移植的干细胞向耳蜗核和听神经定向迁移，移植到内耳的干细胞聚集区趋化因子CXCL12高度表达，而不同强度声刺激会改变耳蜗CXCL12的表达。由于声刺激是内耳发育成熟的必需条件，CXCL12-CXCR4通路是脊椎动物神经干细胞迁移、分化、成熟的普遍信号机制，因此，我们提出科学假说：CXCL12-CXCR4信号在新生鼠耳蜗初级听觉回路建立过程中发挥重要作用，声刺激通过此信号影响听觉发育过程。本课题采用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR和Western Blot 技术观察正常饲养、增强声环境和气导剥夺三种声音条件下CXCL12-CXCR4等趋化因子信号在新生鼠耳蜗表达的时间空间变化，以及阻断该信号对新生鼠螺旋神经元树突生长、突触联系以及听觉功能建立的影响，将有助于进一步阐明哺乳动物听觉发育的分子机制和寻找利用干细胞修复耳蜗

了解听觉传入回路的发育调控机制才能利用干细胞修复螺旋神经元与毛细胞之间特殊的突触联系。前期研究发现增强声刺激可以诱导移植的干细胞向耳蜗核和听神经定向迁移，移植到内耳的干细胞聚集区CXCL12高度表达。因为CXCL12-CXCR4通路是脊椎动物神经干细胞迁移、分化、成熟的普遍信号机制，在大脑发育的细胞迁移和轴突定向延伸过程中有重要作用，而声刺激是新生鼠耳蜗发育成熟和螺旋神经元存活选择的必需条件。因此我们认为，声刺激可能通过CXCL12-CXCR4信号在新生鼠耳蜗发育和听觉建立过程中发挥重要作用。本课题采用免疫组化、免疫荧光、ELISA、RT-PCR和Western Blot 技术观察正常饲养CXCL12-CXCR4趋化因子信号在新生大鼠（生后1天、7天、14天和28天），新生小鼠（生后0天、7天、14天和21天）耳蜗表达的时间空间变化，以及在增强声刺激和气导剥夺两种声音条件下该信号的表达变化，其对新生鼠听觉功能建立的影响。正常饲养组的大鼠耳蜗CXCL12/CXCR4 mRNA 和蛋白表达在生后7天出现高峰，而在14天和28天又回落到接近出生1天的水平。小鼠耳蜗CXCL12/CXCR4 mRNA 和蛋白表达规律与大鼠相似，在生后7天达到高峰，而在14天和21天有所回落，仍较出生0天的水平高。增强声刺激组第28天CXCL12/CXCR4的mRNA 和蛋白表达没有像正常饲养组回落到出生1天的水平，而大概是出生14天一半的水平，比出生一天显著的增强。与此同时，气导剥夺组则在第28天显著减弱了，甚至低于出生1天的水平。免疫组化和免疫荧光的图像定量分析结果与mRNA 和蛋白分析结果相似。增强声刺激和气导剥夺均导致出生28天的听性脑干反应阈升高。体外培养新生小鼠螺旋神经元，在加入CXCL12后CXCR4受体表达增加，神经元树突长度和数量都明显增加，而同时加入受体拮抗剂AMD3100后，CXCR4受体表达和神经元树突的生长都受到抑制。因此，我们的工作印证了之前提出的科学假说：CXCL12-CXCR4信号的时空表达变化与新生鼠耳蜗初级听觉回路建立过程相关，而声刺激可以通过调制这个信号的表达水平而影响听觉发育的过程。本研究对阐明哺乳动物螺旋神经元与毛细胞神经通路发育的分子机制和寻找干细胞修复耳蜗损伤的调控点，实现听觉再生功能，具有重要理论和实际意义。