抗CD226单抗靶向G307S位点免疫治疗1型糖尿病的研究

Type 1 diabetes（T1D）is a highly heterogeneous autoimmune disease mediated by T lymphocyte, personalized immunotherapy based on the pathogenic characteristic of predisposing genes should be applied to halt progressive islet destruction while reducing individual differences of therapeutic efficacy. Our pre-study had indicated CD226 play an important role in the progression of T1D, and anti-CD226 monoclonal antibody (anti-CD226 mAb) treatment could relieve insulitis of non-obese mouse model (NOD) mice.CD226 G307S variant had been identified as the susceptibility gene of Chinese type 1 diabetes in our prior GWAS study, and this SNP was associated with residual islet function.As CD226 costimulatory signaling positively contributes to the activation and proliferation of T lymphocyte, CD226 G307S variant might be the potential pathogenic and therapeutic target. We wonder whether blocking CD226 with neutralizing antibodies could lead to better immune therapeutic efficacy as targeting T1D with CD226 G307S variant？ Through in-vivo experiments on NOD-cd226 transgenic mice and in vitro experiments on CD4+ T cells from T1D patients, we intended to explore the pathogenic mechanism of CD226 G307S variant and its heterogeneity of immune response to anti-CD226 mAb intervention. This research may lay a solid foundation of susceptibility genes targeted immunotherapy strategy.

1型糖尿病(T1D)是T细胞介导的高度异质性自身免疫病，免疫干预能延缓胰岛损伤，但同一治疗方案在不同遗传背景患者间疗效差异大，故个体化免疫治疗方案尚需针对易感基因致病特点制定。我们预实验发现CD226分子在T1D病程进展中发挥重要作用，抗CD226单抗干预能减轻NOD鼠胰岛炎；另本课题组新近GWAS研究发现T1D患者CD226基因多态性G307S与残存胰岛功能相关。CD226正性调控T细胞活化共刺激信号可能是该突变型易感的原因，也是靶向免疫治疗的潜在途径。因此我们推测抗CD226单抗靶向G307S位点免疫治疗突变型T1D可能疗效更佳，本课题拟以抗CD226单抗为干预手段，通过已构建的NOD-cd226转基因鼠体内实验、T1D患者CD4＋T细胞体外实验，探讨CD226基因G307S突变型T1D的致病机制及其对抗CD226单抗免疫干预反应的异质性，为T1D基于基因型的精准靶向免疫治疗提供思路。

1型糖尿病（T1D）是T细胞介导的高度异质性自身免疫病，CD4+T细胞异常分化导致的免疫失稳是致病过程中的关键因素。CD226分子参与调节免疫稳态，在T1D病程进展中发挥重要作用。本研究对中国人群1005名经典自身免疫型T1D患者和1257名健康对照进行CD226基因区域标记SNP的基因分型，探索CD226基因单核苷酸多态性（SNP）与1型糖尿病的关联。使用生物信息学分析对鉴定出的SNP进行功能注释，探索其在发病机制中的作用。利用T1D患者外周血单个核细胞（PBMC）转录组数据对CD226相关的关键信号通路进行评估，并根据结果适当调整实验方案，通过动物试验证实CD226与粘附分子LFA-1的相互作用及其对CD4+T细胞分化的影响机制。全基因组关联研究发现在中国人群中四个CD226基因内含子区域SNP与T1D风险相关，SNP累积遗传风险与T1D患者胰岛自身免疫呈正相关，与残存胰岛β细胞功能没有显著关联性。其中CD226 rs1788238影响转录因子GATA3结合位点，但荧光素酶报告基因实验并未发现序列改变影响CD226转录活性。新发T1D患者PBMC样本转录组芯片数据分析发现，CD226相关差异基因主要在单纯疱疹病毒1感染的通路富集，该病毒可以通过影响细胞粘附分子的附着和能力影响免疫细胞的功能。流式细胞实验及荧光染色证实NOD小鼠CD4+T细胞的CD226及LFA-1表达上调；与正常小鼠相比，NOD小鼠CD4+T细胞增殖显著上调、Treg/Th17比例下调、促炎因子TNF-α、IL-17含量上调。分别使用PBS、CD226单抗、CD226单抗联合LFA-1单抗干预NOD小鼠，从活体及组织水平证实联合阻断CD226及LFA-1可以进一步降低NOD小鼠糖尿病发病率及胰岛炎浸润水平。相较于CD226单抗干预组，联合干预组CD4+T细胞增殖能力进一步下降、Treg/Th17比例上调、促炎因子下调，而抑炎因子TGF-β、IL-10则呈上调趋势。分子实验证实CD226影响了LFA-1受体LCAM-1的表达水平，CD226单抗与LFA-1单抗联合干预可以通过抑制P-GSK-3β信号通路影响CD4+T细胞分化。这些发现加深了我们对CD226基因及其SNP在T1D发病机制中作用的认识，有望为T1D的预防和治疗提供新的潜在靶点。