线粒体DNA损伤在顺铂诱发小细胞肺癌获得性多药耐药中作用机制的研究

肺癌的多药耐药严重防碍了化疗效果。本项目拟采用顺铂诱导成功的小细胞肺癌多药耐药细胞株H446/DDP及其亲代细胞H446为研究对象，以DNA测序技术比较其线粒体mtDNA损伤突变情况；然后分别将去除细胞核的细胞与去除mtDNA的细胞融和，得到H446.ρ0与H446/DDPn0融合细胞和H446 n0 与H446/DDPρ0胞质融合细胞，观察顺铂损伤的mtDNA与非损伤的该两种融合细胞耐药性的变化，采用PCR、Western blot、基因芯片、miRNA芯片等技术研究两者能量代谢特点、胞质内GSH、ROS及Ca2+浓度变化、核转录因子的激活以及核基因、miRNA的差异表达对多药耐药的作用。以期提出和检验"mtDNA损伤是顺铂所致肺癌获得性多药耐药的始动环节"假说，并筛选其耐药相关的分子标记。研究结果可望为认识顺铂致肺癌获得性多药耐药的发生机制以及为获取特异性耐药分子标记提供理论和实验依据

本课题的目的在于提出和验证“线粒体DNA（mtDNA）损伤是顺铂所致肺癌获得性多药耐药（MDR）的始动环节”这一假说，并研究mtDNA损伤对MicroRNA（miRNA）表达谱改变和核基因组遗传不稳定性的影响在小细胞肺癌（SCLC）获得性MDR中的作用。我们首先对比分析了SCLC获得性MDR细胞株H446/CDDP及其亲代细胞H446 mtDNA损伤突变情况；结果表明，此两种细胞株mtDNA顺列没有差异。因此我们及时终止了以mtDNA差异表达为基础的SCLC耐药机制机制研究。在此研究基础上，我们对miRNA表达谱改变和核基因组的遗传不稳定性对SCLC获得性MDR的作用及其机制展开研究并获得了相关成果。.在miRNA表达谱改变对SCLC获得性MDR机制的研究中，我们首先对H446/CDDP及其亲代细胞H446的miRNA表达谱进行了对比分析，筛选出表达差异十分明显的一组miRNA。查阅文献后，我们选取miRNA-137展开研究，并借助相关科研工具预测和筛选了miRNA-137的靶蛋白为KIT；我们采用RNA干扰的方法对miRNA-137的表达进行干预，并观察了miRNA-137高/低表达情况下H446/CDDP和H446两种细胞中KIT的表达变化，细胞的增殖、凋亡情况及其对顺铂的敏感程度的差异；进而明确miRNA-137通过调控KIT的表达参与SCLC获得性MDR。我们将进一步研究所筛选的其它miRNA在SCLC获得性MDR中的作用及机制。.在核基因组的遗传不稳定性对SCLC获得性MDR机制的研究中，我们首先检测了顺铂刺激后上述两种细胞中乳酸（LAC）和活性氧（ROS）的表达水平，明确亲代细胞和耐药细胞抗氧化能力的差异。同时，采用尽可能用覆盖全基因组的多态性微卫星位点对两组细胞的基因组DNA进行比对分析。结果表明，在顺铂刺激下， H446细胞LAC和ROS的产量显著性高于H446/CDDP细胞；并且，在H446/CDDP细胞的3号染色体短臂3p14.2附近发现了两个杂合性丢失位点：D3S1234和D3S1295，在8号染色体的短臂8p22附近和20号染色体上发现微卫星不稳定现象，位点分别为：D8S1145、D20S82。由此我们明确较强的抗氧化损伤能力可能是SCLC获得性MDR重要成因；我们将继续研究微卫星位点突变在SCLC获得性MDR的作用及其机制。