miR-21对增生性瘢痕成纤维细胞PTEN及TGF-β1蛋白调控的作用研究

Hypertrophic scar often occurs after surgery, trauma and burn, in severe cases, it can lead to severe dysfunction and deformity. TGF-β1and PTEN gene were important regulatory factors in hypertrophic scar, but the post-transcriptional mechanism was not clealy. In previous study we found that mir-21 was high expressed in HS, it could predict that mir-21 have a potential regulate effect to TGF-β1and PTEN gene through the TargetScan bioinformatics software, we make the hypothesis that "the high levels of miR-21 inhibit PTEN or promote TGF-β1 post-transcriptional regulation so as to promote the HS formation ". In this study, we cultured normal skin and fibroblasts HS as research object in vitro, build overexpression and antisense expression vector of miR-21 and transfected cells, research the intrinsic link between miR-21 and HS, then find direct regulate role and the targets of miR-21to TGF-β1and PTEN by the activity of the luciferase detected. Finally, we use the HS animal models, observe the prevention effects by inhibit miR-21 on the treatment of HS. The findings will further clarify miR-21 role and mechanism of the formation of the HS, and was expected to provide a new target for the biological treatment of HS.

手术、创伤和烧伤后常发生的增生性瘢痕可导致严重的功能障碍和畸形。TGF-β1及PTEN基因是增生性瘢痕的重要调控因子，但其转录后调控机制尚不明确。前期的研究中发现，miR-21在HS组织中高表达，通过TargetScan等生物信息学软件预测显示miR-21对TGF-β1和PTEN基因存在潜在的调控作用，由此我们提出"高水平miR-21抑制PTEN/促进TGF-β1转录后的调控从而促进了HS形成"的假设。本研究以体外培养的正常皮肤及HS成纤维细胞为研究对象，通过构建miR-21过表达及反义表达载体并转染细胞，研究miR-21与HS间的内在联系，通过荧光素酶活性检测明确miR-21对TGF-β1和PTEN的直接调控作用与作用靶点，最后利用HS动物模型，观察抑制miR-21表达对HS的防治作用。研究结果将深入阐明miR-21在HS形成中的作用及机制，并有望为HS的生物学治疗提供新的靶点。

手术、创伤和烧伤后常发生的增生性瘢痕可导致严重的功能障碍和畸形。MicroRNAs(miRNAs)是一种长约 22nt 的单链小分子 RNA，可通过与 mRNA 分子序列互补相结合，参与基因转录后水平调控 ，目前已有 700 多个 miRNAs 被发现，调控机体内 1/3 以上基因表达，参与包括胚胎发育、干细胞分化、细胞增殖与凋亡，造血生成及激素分泌等多种生物学过程。研究表明，miR-21 是纤维化疾病中最常见的高表达 miRNAs 之一。Liu 等在针对特发性肺纤维化（IPF）的研究中证实，miR-21 表达水平明显增高。在心脏肥厚大鼠的心肌细胞中， miR-21 表达显著增高，敲除 miR-21 可抑制心肌细胞的肥大，其机制可能与调控 TGF-β1 表达有关。上述研究表明，在纤维化疾病中，miR-21 可以通过对相关基因的调控，促进胶原蛋白的沉积，从而加速纤维化的发生，拮抗其表达，则可抑制纤维化的发生。尽管 miR-21 与其他纤维化疾病关系的研究已取得了一定的进展，但与 HS 形成关系的研究尚未见文献报道。根据上述研究结果，结合前述的相关文献，我们推测，由于人类皮肤创伤愈合后 miR-21 持续高表达，使HS 成纤维细胞凋亡减少、促进了细胞增殖及胶原等 ECM 过度沉积，从而促进了HS 的形成。.我们通过对 HS 与正常皮肤组织（各 3 个样本）进行 mircoRNA 芯片检测后发现，两种组织中 microRNA 表达谱存在明显差异，其中，在 3 个增生性瘢痕样本中miR-21 分子表达均显著高于正常皮肤组织（平均高 4.1 倍）。在基因芯片检测的前提下，采用定量 PCR 方法对 HS 组织中 miR-21 分子进行了再验证，确认了 HS 组织中 miR-21 的高水平表达。随后，通过绘制生长曲线及 MTT 法检测细胞的增殖情况，采用流式细胞术分析细胞的凋亡及细胞周期，定量 PCR 检测 COL A1，COL A2 及5Fn 的 mRNA 表达变化，明确 mir-21-inhibitor 对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡与增殖的及细胞外基质影响。最后，应用兔耳瘢痕增生性瘢痕模型，将 miR-21 抑制剂直接注入增生性瘢痕中，结果发现 miR-21 抑制剂可以使瘢痕厚度明显下降，治疗组的瘢痕平整，硬度变软，胶原沉积也减少。