自噬蛋白在自噬体形成过程中的时序作用模型的建立

Autophagy is a major pathway for the clearance of intracellular materials. It is indispensable for the health of eukaryotic organisms, including human beings. The formation of the sequestration vesicles, autophagosomes, is the central step in the pathway and a focus of current research. In our preliminary study, we successfully constructed a newly-designed red fluorescent protein (RFP) with much improved function, eliminating a major obstacle in the utilization of RFPs in our field. We further found that Atg1, which is generally considered to act early during autophagosome formation, plays a different role at a later stage. Based on these findings, we set out to establish the temporal order of the actions of major Atg proteins during autophagosome formation by systematic live cell imaging. Focusing on the dissociation of specific Atg proteins from the PAS, we will explore the structural basis for the multi-functionality phenomena among Atg proteins. Our analysis will cover all the major Atg proteins. By combining live cell imaging, genetic and biochemical approaches, we seek to build a brand new temporal framework for the roles of Atg proteins during autophagosome formation; our work will also offer a new perspective on the subject of "multi-role" Atg proteins.

细胞自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的基本途径，对维持包括人类在内的真核生物的健康具有不可替代的作用。降解囊泡"自噬体"的形成是这一通路的核心步骤，也是当前本领域研究的重点之一。我们在前期工作中成功改良了现有红色荧光蛋白，解决了RFP在本领域应用的缺陷。我们另外发现：自噬蛋白Atg1不仅在此前一般设想的自噬起始阶段发挥作用，它在自噬体形成后期另有不同的功能。在此基础上，我们一方面将系统的通过活细胞显微观测确定各主要Atg蛋白在PAS参与自噬体形成的时间区段；另一方面将以部分Atg蛋白从PAS解离的现象为切入点，对包括Atg1在内的多阶段作用/多功能的自噬蛋白的"结构-功能"基础进行探索。我们的研究将全面覆盖当前已知的主要Atg蛋白。通过综合利用活细胞观测、遗传、生化等手段，我们有望获得一个全新的Atg蛋白参与自噬体形成的时序框架，并对部分多功能Atg蛋白的作用机制提出独特的诠释。

本项目的工作以酵母为模式生物研究主要自噬蛋白在自噬体形成周期中发挥作用的时间序列以及这一序列的调控机制。我们构建了已知的主要Atg蛋白的绿色荧光蛋白标记，而后以红色荧光蛋白标记的Atg8作为自噬体形成周期的指示，系统地确定了主要Atg蛋白在周期中的作用阶段。Atg8在自噬体膜扩展的阶段在其上募集，并呈现光学显微镜下可辩别的形态扩展；在自噬体膜完成扩展后，Atg8逐渐从自噬体膜解离，信号下降；全部过程耗时约8分钟。结果显示，其他Atg蛋白依照其作用阶段可以分为三类：一类是与Atg8近似，信号在自噬体形成全周期均存在。这类蛋白仅有Atg1，其出现比Atg8早约1分钟，消失时间基本相同。第二类是作用于起始阶段。以Atg17为代表，这类蛋白出现早于Atg8约1分钟，消失则在Atg8出现后2分钟。第三类是延展阶段。以Atg2为代表，其出现晚于Atg8约1分钟，消失在Atg8出现后4分钟。此前研究对Atg1在自噬起始信号调控中的作用关注较多，而我们观察到的作用阶段则提示Atg1在中后期仍可能有关键作用。与此猜测一致，我们的结果显示，Atg1-Atg8的互作参与Atg蛋白解离过程的调控。Atg1-Atg8的互作尽管也用到AIM肽段，但其涉及的亚基与互作类别与Atg19的经典AIM不同。通过选择性的突变Atg8表面相应区域，可以特异性地阻断Atg1-Atg8互作，进而造成Atg8自身解离放慢，也造成Atg9囊泡逆向运输速率下降。我们的工作为全面、系统地理解自噬体形成过程提供了新的视角和数据。