鱼类特有的三种IL-23异构体的鉴定及其免疫调节功能和机制探究

Interleukin-23 is a heterodimeric cytokine comprising of covalently linked p19 and p40 subunit. In fish, three genes coding p40 (p40a, p40b and p40c) are originated from fish-specific genome duplication, thereby generating three IL-23 isoforms. Considering the functional diversity of fish IL-23, it is possible that the fish-specific immunoregulatory mechanism of IL-23 is existed. In fact, our preliminary data demonstrated the functional conservation, specificity and diversity of two grass carp IL-23 isoforms. In this project, the recombinant proteins of grass carp IL-23 isoforms and p19/p40 single subunit will be prepared and their functions will be compared in grass carp leukocytes. To uncover the regulatory mechanism of grass carp IL-23 isoforms, we will not only clarify the receptors, signal pathways and transcription factors of IL-23 isoforms but also elucidate their regulatory mechanism on target gene transcription. To reinforce their roles in fish immunity, further studies will be carried out to determine their effects on the activity and cellular signals of inflammation-related cytokines. Their expression patterns and regulation in the inflammatory model will be investigated to reveal their roles in the internal regulatory networks and mechanism to fine tune fish inflammation response. Taken together, our study will identify new molecules and novel mechanisms specific for fish involving in the regulation of immune and inflammatory response, being beneficial to enrich our knowledge on fish immunity, particularly the evolutional mechanism of fish immune system.

哺乳动物IL-23是由p19和p40两个亚基构成的异源二聚体，而鱼类特异全基因组复制导致有p40a、p40b和p40c三个编码基因。因此，鱼类IL-23可能有三种异构体，提示鱼类存在基于IL-23分子多样性的独特免疫调节机制。本项目在初步发现了两种草鱼IL-23异构体的功能保守性、独特性和差异性的基础上，鉴定和比较草鱼IL-23的异源二聚体和p19/p40单亚基蛋白的功能和相互作用关系，阐明它们发挥功能的受体、信号通路、转录因子和调控转录的机制。通过检测草鱼IL-23异构体对炎症相关细胞因子活性和信号通路的影响，以及在炎症模型中检验它们的表达规律和调节作用，确立它们在精细调控鱼类炎症反应的网络和机制中的地位。课题将在鉴定鱼类特异新分子基础上阐明免疫调节和炎症调控的新机制，从而揭示基于鱼类特异基因组复制的免疫分子多样性的生理意义，为诠释鱼类免疫系统在环境适应过程中成功进化提供线索和依据。

草鱼IL-23由一个基因编码的p19亚基和三个基因编码的p40亚基组成，进化分析提示p40a和p40b由同源基因通过全基因组复制产生，但p40c来源于另一个未知的祖先基因。免疫共沉淀分析证明了异源二聚体IL-23a，IL-23b和IL-23c的存在，为此制备三个IL-23异构体重组蛋白。在草鱼头肾白细胞（HKL）中，它们类似于哺乳动物同源分子，上调Th17细胞信号分子IL-17A/F1、IL-21、IL-22和IL-26，以及IL-23特异受体的基因表达，且促进IL-17A/F1的分泌。信号通路机制研究揭示了STAT3, JNK和ERK 通路的参与。此外，它们与IL-1β存在互作关系，包括HKL中IL-1β能够放大它们对IL-17A/F1、IL-22和IL-26（非IL-21）的基因表达。另外，三个异构体均上调IL-1β和IFN-γ的基因表达，同时IL-23a和IL-23b（非IL-23c）上调TNF-α、IL-10和TGF-β1的转录。体内实验发现IL-23c显著降低嗜水气单胞菌感染草鱼的肝脏菌荷量，改善菌对肠粘膜组织的损伤。这些结果揭示了草鱼IL-23异构体的炎症调控地位。有意义的是，新发现三个p40亚基蛋白的表达和功能具有鱼类特色。非还原电泳和免疫印迹分析发现，LPS，IL-1β和TNF-α在HKL中刺激三个单亚基蛋白大量分泌，提示可能具备功能。它们的重组蛋白在HKL中明显诱导草鱼IL-1β和TNF-α分泌，体内实验发现它们造成小肠绒毛稀疏和充血，且促进嗜水气单胞菌导致的小肠绒毛和上皮细胞的脱落。而它们的抗体能够改善细菌引起的小肠组织学变化，验证了它们的促炎症性质。意外的是，三个蛋白经相似信号通路诱导Th17反应，因此叠加或放大IL-23诱导的IL-17A/F1表达，完全异于哺乳动物中的发现。另外，草鱼p40也有三个同源二聚体，它们同样诱导Th17反应，但又发挥单体蛋白不具有的上调iNOS表达和一氧化氮产生的功能。总之，结果揭示草鱼IL-23、单体和同源二聚体p40有三个异构体形式，在调节Th17信号分子表达方面表现出功能保守性和一致性，特别强化了鱼类Th17反应的重要性；同时，它们在炎症调控中发挥相似或不同作用，增添了鱼类特有免疫的内容。