确认Toll样受体9（TLR9）结合CpG DNA结构域的实验研究

TLR9是识别CpG DNA的受体，确定TLR9识别CpG DNA的结构域具有重要意义。本项目在前期发现TLR9胞外段LRR2、5、11具有抑制细菌生长、与CpG DNA具有一定结合力的基础上，首先检测人工合成LRRs多肽与CpG DNA的亲和力（Kd值），初步确定高Kd值的LRR为TLR9结合CpG DNA的结构域（BD）；观察BD对单核细胞TNF-α释放和CpG DNA内化的影响，确定BD。然后采用生物信息学技术分析LRRs结构的特点，初步确定BD的重要氨基酸位点；细菌生长抑制实验再次确定BD中重要的氨基酸位点；检测人工合成突变多肽与CpG DNA的Kd值；观察突变多肽对TNF-α释放和CpG DNA内化数量的影响，明确重要的氨基酸位点。最后，在HEK细胞株中转染双报告基因系统，比较野生型TLR9和TLR9的BD突变体活化NFκB的强度，最终确定TLR9的BD和重要氨基酸位点。

通过生物信息学分析、生物传感器和LRR多肽活性研究等策略，明确LRR11是人TLR9结合CpG ODN的主要结构域，5个正电荷位点尤其是R337、K338是LRR11结合CpG ODN的关键位点，完成本项目研究内容并达到预期目标。.人工合成预期可结合CpG ODN的TLR9胞外段LRR2、5、8、11片段（命名为LRR2、5、8、11多肽），生物传感器检测LRR多肽与CpG ODN的亲和力，仅LRR11具有高亲和力（4.79 nM），LRR2、5亲和力低，而LRR8几无亲和力；圆二色谱实验也表明LRR11可显著改变CpG ODN的空间构象，其余LRR作用较弱或无作用。进一步激光共聚焦检测显示LRR11对小鼠腹腔巨噬细胞内化CpG ODN的抑制作用最强，具有显著的量效关系；且LRR11对CpG ODN诱导的IκB降解、NF-κB活化及炎症细胞因子释放均有很强的抑制作用，具有高特异性和显著量效关系。采用CpG ODN刺激含野生型TLR9和突变TLR9的HEK293T细胞，显示LRR11缺失后TLR9通路活化下降显著，确认LRR11是CpG ODN的主要结合域。.为明确LRR11中重要的氨基酸位点，对TLR9和LRR11进行生物信息学分析，显示LRR11的5个正电荷位点R337、K338、K347、R348和H353形成2个正电荷区域，可结合带负电的CpG ODN。进一步检测上述5个位点单突变或组合突变的多肽（LRR11突变肽）与CpG ODN的亲和力，显示其与CpG ODN的亲和力均下降，R337、K338突变肽下降最多。在细胞实验中，突变肽不同程度逆转LRR11对CpG ODN内化和TLR9通路活化的抑制作用，其中含R337、K338的突变肽影响最大。TLR9和CpG ODN的分子对接显示R337和K338通过氢键与CpG ODN结合，而K347、R348和H353不直接结合CpG ODN，但可维持受体与CpG ODN结合面的稳定。上述结果表明5个正电荷位点尤其是R337、K338是LRR11结合CpG ODN的关键位点。.超额完成计划任务，在著名SCI刊物The Journal of Biological Chemistry (JBC)发表论著1篇（IF4.773>3.0），国内CSCD期刊发表专家述评1篇，达到预期研究成果要求，并额外获国家发明专利授权1项。