GSN在MS/EAE发病过程中的作用机制研究

The potential functions of GSN and DBP are attracting more and more attention in recent years. In our previous research, close association between GSN, vitamin binding protein(DBP) and multiple sclerosis(MS) was discoverd. GSN significantly reduced in cerebrospinal fluid(CSF) and serum of MS patients compared with control group. In addition, GSN was discoverd interacting with some novel proteins and small molecule compounds in other inflammatory diseases, which would involved in preventing tissue from inflammatory injury and immune regulation. These findings suggested GSN would play potiential roles in various biology progresses and biomolecule interaction networks in MS/EAE. In our project, animal models of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), primary cultured neurons model of rats and human CSF/serum would be analysed by molecular biology, proteomics, immunology and animal model technology in order to investigate the function and the mechanism of GSN(including its level and activity) in the process of MS from a systems biology point of view, seek nevol biomolecules related to MS/EAE, which would interact with GSN, and expand GSN biological network access. Our project would be of great clinical significance to study the pathogenesis of MS and search for potential biomarkers and drug targets.

近年来，关于凝溶胶蛋白（GSN）和维生素D结合蛋白（DBP）在多发性硬化（MS）中的作用倍受关注。我们的前期研究表明GSN含量水平与MS呈显著相关性，并提示其活性与MS亦有密切联系。同时，由于在其他炎性疾病中已发现GSN可与多种蛋白和生物活性小分子相互作用，其中涉及防止炎性损伤、免疫调控等多种生物过程，这表明GSN在MS/EAE过程中亦可能存在多种相互作用网络通路。本课题基于前期的相关发现，拟以人类体液、动物模型组织样本、原代神经元细胞为研究对象，首次从EASS、免疫调控、细胞抗凋亡能力等多个角度探讨GSN含量及活性变化在MS中的作用及相关机制；并通过蛋白质相互作用组学技术和小分子化合物质谱鉴定技术，寻找与GSN相互作用的其他未知分子，扩展其生物网络通路。这对发掘具有潜在临床诊断和治疗功能的候选蛋白，寻找治疗MS的有效药物靶标具有重要意义。

多发性硬化(MS)症是一种发病原因不明的中枢神经系统(CNS)自身免疫性、炎性、脱髓鞘疾病。近年，关于凝溶胶蛋白(GSN)和维生素 D(VD)在MS中的作用倍受关注。本课题组的前期研究表明 GSN 和VD水平与 MS 呈显著相关性。据此，本项目利用人类体液、动物模型—实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)组织样本、神经元细胞常用细胞株PC12为研究对象，深入研究了GSN和VD在MS/EAE中的作用机制。首先利用western blot技术再次验证MS病人的脑脊液和血液中GSN表达量较患有其他神经系统疾病(OND)病人有显著降低，其与前期2-D DIGE结果一致。随后，成功诱导了Lewis大鼠的EAE模型，H&E染色结果表明炎症浸润在EAE大鼠脊髓中比较明显。通过对EAE大鼠补充VD发现：补充VD的EAE大鼠发病时间明显推迟，炎性损伤减少，但作用有限。进一步研究发现，VD可使EAE大鼠血清和脊髓中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和GSN的含量下调，而VD 对GSN的下调可能削弱了VD在MS/EAE中的治疗作用。我们又首次利用对EAE大鼠同时补充VD与芬戈莫德(FTY720)的方法发现，VD在EAE中的治疗作用可能是通过下调EAE体内S1P的含量实现的，进一步的机制研究表明VD可通过结合其体内的维生素D受体(VDR)下调S1P的合成酶--鞘氨醇激酶1(SPHK1)的含量来下调S1P的含量。首次通过升高EAE体内GSN含量方法，证实GSN在EAE发病过程中的保护性作用，首次发现补充VD的同时提高EAE体内GSN的含量可增强VD在EAE中的预防和治疗作用。机制研究结果表明，VD可通过结合VDR下调GSN的含量。功能验证实验证实，胞质型凝溶胶蛋白(cGSN)在神经元凋亡过程中起保护作用：转染GSN的小干扰RNA(siGSN)组，细胞凋亡率明显高于转染对照siRNA(NC)组。本课题组还利用iTRAQ质谱技术，从EAE发病前后和补充VD前后的大鼠脊髓和血清样本中发现了数十种差异表达蛋白，为后续研究VD对EAE的预防和治疗机制提供靶标候选蛋白。由此我们得出结论：GSN和VD均在EAE的发病过程中起保护性作用，在补充VD的同时，增加机体内GSN含量，可以增强VD对EAE/MS的预防和治疗效果。这对临床应用GSN和VD预防和治疗MS提供了新的思路和理论实验依据。本项目的实施基本按照基金项目内容