DBP（Vitamin D Binding Protein）在多发性硬化中的作用和相关机制的蛋白质组学研究

本课题组在对人类脑脊液的前期研究中已首次提出维生素D结合蛋白（DBP）可能是诊断和研究多发性硬化（MS）的候选蛋白。有研究表明，除了已知运输Vitamin D的功能，DBP还可能具有某些免疫调节作用；在CNS中，DBP可能作为中枢神经活性物质和促垂体因子而具有潜在的重要功能。本项目在前期工作基础上，以MS人类体液（血清、脑脊液）和EAE鼠动物模型组织样品为研究对象，利用一系列定量蛋白质组学技术，寻找与MS相关的特异性生物标志物，进而从系统生物学的角度研究DBP在MS中的作用和相关机制，并结合其他分子生物学手段进行验证；此外，分析国人DBP不同基因多态性与MS的相关性，以辅助优化本项目的实验设计，减少标本间的个体差异。本项目旨在寻找MS特异性生物标志物，研究DBP在MS中对中枢神经系统的作用机制；这对深入探讨MS发病机制、发掘具有潜在临床治疗功能的候选蛋白和药物靶标具有重要意义。

本项目根据MS发病病程特点主要以复发缓解型（RRMS）和继发进展型（SPMS）的病人血清、脑脊液为研究对象，利用定量蛋白质组学技术，筛选到了与MS相关的如DBP、GSN和C4b等具有潜在生物学意义的标志物并从系统生物学的角度研究探讨这些候选蛋白间在MS中的作用和相关机制：通过实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型，验证和探讨了候选靶标DBP与该疾病间的关系并探讨了DBP受VD调控对MS的影响，为临床诊断和治疗提供了理论与实验依据。首先成功获得了实验及对照组人脑脊液荧光定量蛋白质组差异表达2-D DIGE图谱，经相关软件分析，显示13个蛋白质点在两组图谱上存在显著差异，这些蛋白点分别对应8种蛋白。其中DBP在实验组中明显上调，Western blot 半定量分析结果与2-D DIGE结果一致。成功诱导了EAE大鼠模型，HE染色可见EAE大鼠的脊髓组织明显发生病理变化，主要表现为血管呈套袖样改变，血管周围有炎症细胞浸润。首次通过免疫组化发现，大鼠脊髓的神经元胞浆内有DBP的表达分布，反转录PCR证明脊髓组织可以合成DBP的mRNA。对模型组和对照组脊髓组织中DBP进行Western blot分析，发现模型组中DBP含量明显升高，而荧光定量PCR结果表明模型组脊髓组织DBP的mRNA含量却没有明显升高。在动物模型中，补充维生素D以后，+DC组血液中25-(OH)D3的含量显著高于-DC组，并且+DC和+DE组血液的1,25-(OH)2D3均高于-DC和-DE组。而在脊髓组织中1,25-(OH)2D3 在+DE和-DE组中的含量没有显著差异，然而-DE组DBP的含量明显高于+DE组。相对于-DE组，+DE组的大鼠发病推迟，症状减轻，并具有统计学意义。我们的结论是：DBP可作为SPMS的生物学标记物的候选蛋白。游离水平维生素D含量的增加有利于MS病人的恢复，特别是对SPMS病人的临床治疗会更有效。本项目的实施基本按照基金项目内容执行并圆满地完成。正式发表了3篇与本项目直接相关的学术论文。其中有两篇研究论文发表在国际著名学术期刊《Molecular Neurobiology》IF=5.735及《J Cell Biochem》IF=3.54上，参加了3次国际学术会议交流，其中1次为分会报告，2次为墙展。还有2篇英文文章正在SCI投稿中。在研期间培养研究生4名，1名博士在读。