染色质结合蛋白Pwp1在胚胎干细胞多能性维持和分化中的作用机制

Polycomb group (PcG) and Trithorax group (TrxG) proteins are two very important families of epigenetic regulatory factors, which play very important roles in the maintenance of specific gene silencing and activation in the regulation of stem cell pluripotency and differentiation. Our previous results showed that chromatin binding protein Pwp1 has a very specific expression profile, showing high expression in ES cell stages, the interaction between Pwp1 and pluripotency genes Oct4 and Sox2 by coimmunoprecipitation, and decreasing progressively with the loss of pluripotency, indicating that Pwp1 possibly plays an important role in the pluripotent regulatory and differentiation network. To this end, our project intends to demonstrate the functions of Pwp1 in pluripotency regulation and differentiation of embryonic stem cells, cell morphology, pluripotent gene expression profile, in vitro and in vivo differentiation into all three germ layers, and other aspects are investigated through lentiviral vector-mediated RNA interference technology to knockdown Pwp1 expression in embryonic stem cell. Our studies aim to further explore whether Pwp1 participate in the regulation of developmental gene expression Polycomb group or Trithorax group chromatin complexes. Our study will reveal the molecular interactions between the core pluripotency factors and the chromatin binding protein Pwp1 by ChIP-seq and coimmunoprecipitation (CoIP) assays, and provide the theoretical basis for the clinical application of ES cells.

Polycomb group (PcG）和Trithorax group（TrxG）蛋白是表观遗传调控因子中非常重要的两个家族，参与维持特定基因的沉默和激活，在调控干细胞多能性维持与分化中起着非常重要的作用。Pwp1是一种染色质结合蛋白，我们前期的研究结果显示Pwp1在ES细胞中特异性高表达；免疫共沉淀证实Pwp1与多潜能基因Oct4和Sox2之间存在相互作用；并发现在ES细胞中干扰Pwp1的表达导致分化潜能丢失，推测Pwp1很可能在多能性调控与分化网络中扮演重要的角色。为此，本课题拟通过在胚胎干细胞中稳定干扰Pwp1的表达，从细胞形态、多能性基因表达、体内外分化等方面揭示Pwp1在ES细胞中的功能；探索Pwp1是否通过参与多体复合物PcG 或TrxG的形成调控ES细胞的分化；并通过ChIPseq和CoIP技术充分揭示Pwp1在多能性调控网络中的作用机制，为ES细胞的临床应用奠定理论基础。

ES细胞的分化潜能受到多种因子的调节，包括转录因子，非编码RNA以及染色体调节蛋白等。LIF/Stat3通路是调节ES细胞全能性和分化的一个关键性通路，当在培养基中撤掉LIF时，小鼠的ES细胞即启动分化程序并开始分化。通过分析前期的芯片数据，我们发现在干扰 Pwp1的细胞中，Jak-Stat3通路基因的表达水平显著上升，被改变的还有与干性关系密切的另一个通路Wnt通路。通过定量PCR和western实验，我们证实这两个通路关键基因的表达的确发生了变化。之后，通过使用信号通路抑制剂对改变的信号通路进行修复，我们发现当把Stat3通路抑制时，ES细胞的分化潜能得到了恢复。在干扰 Pwp1的ES细胞培养基中加入Stat3抑制剂时，细胞不但又恢复了分化的形态，而且分化基因的表达也升高了。因此我们发现，Pwp1影响ES细胞的分化潜能主要通过影响Stat3通路来实现。Pwp1是一个染色体结合蛋白，它影响一个基因表达必然与染色体重塑相关。之前研究发现，Pwp1可以与H4紧密结合。有研究还证实，Pwp1家族的成员Wdr5和Eed能够分别影响和调节H3K4和H3K27的三甲基化。因此，我们推测Pwp1很可能与H4上最主要的甲基化修饰位点—H4K20相关。我们发现，当干扰Pwp1时，ES细胞的H4K20me3的水平显著降低。研究发现，H4K20me3能抑制基因的表达，因此我们推测Stat3的表达受到影响是因为H4K20me3的结合减少导致的。我们在Stat3的DNA序列上找了三个靶点，发现Pwp1和H4K20me3与其都有结合，并且随着Pwp1的表达降低，Pwp1和H4K20me3在Stat3上的结合降低了。因此，Pwp1通过影响H4K20me3的甲基化进而影响Stat3的表达。综上所述，我们的研究发现了一个调控ES细胞分化的新蛋白——Pwp1，当它被干扰时，虽然并不影响ES细胞的增殖与凋亡，但是其分化潜能受到了严重的影响。Pwp1影响ES细胞的分化潜能与Stat3密切相关，如果在干扰Pwp1的时候抑制Stat3的表达，将能够修复Pwp1抑制分化的效果。最后我们还证明了Pwp1影响Stat3的表达可能与其能够影响H4K20me3相关。研究揭示了一个在哺乳动物细胞中，尤其是小鼠ES细胞中Pwp1的一个新功能，为下一步研究Pwp1在其它细胞比如人的ES细胞以及肿瘤细胞中的功能提供了参考。