多聚泛素化在胚胎干细胞的多能性维持与神经分化中的作用机理研究

Ubiquitination entails covalent attachment of different ubiquitin chains to protein substrates. It plays pivotal roles in almost every process in eukaryotic cells via altering the functions of the protein substrates, including pluripotency maintenance and differentiation of embryonic stem cells. Our previous studies provided an interaction landscape of ubiquitin signalling in a proteome-wide level. We identified a series of linkage-selective ubiquitin chains interactors, and verified UCHL3 as the first K27 linkage-selective interactor. Furthermore, our recent studies have identified that the polycomb repressor-deubiquitinase (PR-DUB) complex, which deubiquitinates monoubiquitinated-H2A, selectively interacts with K29 and K63 ubiquitin linkages. The purposes of this proposal are to explore the dynamics of ubiquitylome and the functions of ubiquitin signalling in embryonic stem cells and neural progenitor cells. To achieve that, we will make use of linkage-selective ubiquitin binding domains to enrich ubiquitinated proteins followed by mass spectrometry measurement. In the meantime, we will investigate the molecular mechanisms of how PR-DUB and UCHL3 regulate the DNA damage response in embryonic stem cells.

泛素化通过共价结合不同的泛素链到底物蛋白上来影响它们的功能。泛素化参与调节几乎所有的真核细胞功能，其中包括胚胎干细胞多能性的维持与分化。申请人的前期工作在蛋白质组水平上系统地报道了泛素信号通路的相互作用蛋白，鉴定了一系列可以选择性结合特异泛素化链的蛋白，并发现了第一个K27多聚泛素化链的选择性结合蛋白UCHL3。申请人课题组近期的进一步研究发现了单泛素化H2A的去泛素化酶复合体（PR-DUB）可以特异地结合K29和K63泛素化链。本项目拟在此基础上，利用选择性结合不同多聚泛素化链的蛋白结构域，结合定量蛋白质谱分析，系统地研究泛素信号通路在胚胎干细胞与神经前体细胞中泛素化蛋白的水平与功能。同时研究PR-DUB与UCHL3调控胚胎干细胞DNA损伤反应的分子机制。

泛素化是真核细胞内最重要的蛋白翻译后修饰的一种。通过改变蛋白底物的特性，如稳定性，定位，泛素化参与调控几乎所有的生物学过程。泛素化根据其结合到底物蛋白上的泛素数量和拓扑学结构，可以分为单泛素化，多次单泛素化和多聚泛素化。其中多聚泛素化又细分为八种（K6, K11, K27, 29, K33, K48, K63和Met1）同型多聚泛素化。不同类型的泛素化对蛋白底物的功能有不同的影响。本项目旨在表达不同泛素化链的特异富集结构域用于富集和研究不同类型的多聚泛素化，同时研究不同类型泛素化在细胞内如NF-B信号通路，DNA损伤修复和细胞命运调控中的作用。在本项目中：1）我们成功地构建并表达纯化了用于富集不同类型泛素链的泛素结构域。这些纯化的蛋白可以用于富集细胞内源水平上的泛素化蛋白用于研究细胞内泛素化的底物；2）发现SNX27与线性泛素化链的相互作用是依赖于去泛素化酶OTULIN的表达，同时阐明了SNX27是通过逆转运复合物将OTULIN运输到TNFR复合物附近进而去除线性泛素化和抑制NF-kB信号通路的激活。这一研究为我们理解细胞是如何调控线性泛素化链提供了新的思路；3）利用蛋白质组学手段研究了SS18蛋白是如何与BAF复合物相互作用并参与胚胎干细胞的命运调控，为操控细胞命运转变提供了新的靶标；4）申请人还积极参与了新冠相关的研究，成功克隆了SARS-CoV病毒的NSP3蛋白，并首次从多组学的角度研究了NSP3蛋白参与调控的宿主细胞功能，为更深入地了解新冠病毒感染人体后带来的变化提供了理论基础。本项目的成功实施共发表了6篇标注论文，其中5篇为研究论文（Cell & Bioscience, The FASEB Journal, Genomics, Proteomics & Bioinformatics, Nature Communications和中国生物化学与分子生物学学报），1篇为综述（Proteomics）。同时申请人团队在本项目资助期间毕业了硕士研究生2名，博士研究生1名。