周期性色氨酸蛋白1(Pwp1) 在胚胎干细胞端粒长度调控中的机制研究

The regulation of telomere length is a hotspot in the areas of stem cell maintenance and tumorigenesis. Our recent study revealed that downregulation of Pwp1 could accelerate to shorten of telomere length in ES cells. Preliminary data showed that Pwp1 might be involved in the regulation of telomere length by a variety of signal regulatory pathway (alternative lengthening of telomeres relative factor Zscan4, H4K20me3 and telomere end protection protein shelterin complexes). Therefore, this project through the inducible shRNA / knockout of Pwp1 ES cells and Pwp1 knockout mice to clarify the role of Pwp1 in regulating telomere length determine whether Pwp1 regulates telomere length through telomerase activity, alternative lengthening of telomeres, histone modifications and the formation of telomere end protection protein complex shelterin in ES cells, and using the ChIP-seq analysis enrichment sites of histone H4k20me3 and H3K9me3 in knockout or wild type ES cells, and immunoprecipitation combined with mass spectrometry analysis key proteins combined with pwp1, and conditional knockout mice to test the function of pwp1,further revealing the molecular mechanisms of Pwp1 involving in telomere length regulation. Base on the study of our project, we would provide a theoretical basis for the development of pluripotent stem cells in clinical application and analysis of telomere regulating related diseases.

端粒长度调控是干细胞与肿瘤领域的热点问题。我们最新研究发现下调Pwp1能快速引起胚胎干细胞（ES细胞）端粒长度的缩短，初步数据显示Pwp1参与了端粒长度调控的多种方式相关分子调控与结合（非端粒酶依赖的端粒加长机制相关因子Zscan4、H4K20me3以及端粒末端保护蛋白复合物Shelterin等）。为此，本课题拟以可诱导干扰/敲除Pwp1的ES细胞以及Pwp1条件性敲除小鼠为研究对象，通过ChIP-seq分析组蛋白H4K20me3/H3K9me3在敲除前后的差异性富集位点，CoIP/质谱分析与Pwp1结合的关键蛋白以及条件性敲除小鼠体内功能试验等方法，从端粒酶活性、非端粒酶依赖的端粒加长、组蛋白修饰以及端粒末端保护蛋白复合物Shelterin等方面系统的阐明Pwp1调控端粒长度的分子机制，为多能干细胞的临床应用以及解析端粒相关疾病的发生发展提供理论依据。

绝大多数情况下，端粒通过端粒酶采用逆转录的方式完成对自身的延长。在某些特定细胞或者特定条件下，端粒延长替代机制以同源重组的方法完成对端粒的延长。DNA甲基化，组蛋白乙酰化，组蛋白甲基化等，这些表观遗传修饰在端粒区和亚端粒区的增多或减少，都会对端粒长度产生不同影响。值得关注的是更多的研究显示端粒长度调控是一个十分复杂的过程，而对端粒长度稳定的维持过程仍需要更为全面更为细致的研究。.我们的研究发现，富含WD-40结构域的染色质结合蛋白Pwp1能够参与端粒长度稳定的调节过程。在缺少Pwp1的小鼠胚胎干细胞和小鼠模型中，端粒长度明显变短。在小鼠胚胎干细胞中，Pwp1减少导致的端粒缩短十分迅速，敲降Pwp1 48 h即可出现。在小鼠模型中，单敲Pwp1会引起小鼠出生率降低，双敲Pwp1疑似会导致小鼠胚胎发育过程中出现胚胎致死。Pwp1减少使得Shelterin复合物在端粒区的富集水平降低，对端粒末端的保护功能受损，同时造成 DNA损伤加剧。机制上，Pwp1与端粒保护蛋白Shelterin复合物的多个蛋白组分具有相互结合关系。Pwp1能够通过其对Shelterin复合物在端粒区富集水平的影响来实现其对端粒长度的调节。在对Pwp1减少导致端粒缩短后的恢复中，我们发现Pwp1对端粒长度的恢复依赖于组蛋白修饰H4K20me3的正常态。短期减少Pwp1时，H4K20me3不发生改变，单独的Pwp1能够恢复已经变短的端粒长度。长期减少Pwp1时，H4K20me3发生改变，Pwp1必须与H4K20me3的甲基转移酶Suv4-20h2共同作用才能够完成对已变短端粒长度的恢复。Pwp1与Suv4-20h2具有相互结合关系，并且其第一个WD-40结构域对这一结合关系至关重要。特异性针对Pwp1第一个WD-40结构域的突变体与Suv-20h2的结合关系受损，两者无法在共同作用下现对Pwp1缺失细胞中短端粒的长度恢复。至此，我们的研究展示一种能够参与端粒长度稳定调节的蛋白Pwp1，以及一种调节端粒长度稳定的方式即Pwp1通过其与Shelterin复合物的结合来实现其对端粒长度的影响并依赖H4K20me3的正常态完成其对端粒长度的恢复。这些研究将有助于提高和深化我们对染色质结构和组蛋白修饰如何参与维持端粒稳定的理解。