ERK5-MEF2信号转导在肝星状细胞活化中的作用及红花活性成分对其干预机制的研究

肝纤维化为多种慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化，肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的病理关键，转化生长因子β1（TGF-β1）在肝纤维化形成中起着核心作用。ERK5信号转导通路是HSC活化过程中一条重要的通路，抑制活化信号在HSC内的传导是治疗肝纤维化的重要策略。红花是治疗肝纤维化的传统中药。本项目拟采用CCl4诱导肝纤维化动物模型和TGF-β1活化HSC细胞模型，通过RNA干扰、免疫组化、ELISA、Western blot、荧光素酶活性分析和实时定量RT-PCR等实验方法，研究红花活性成分羟基红花黄色素A（HSYA）抗肝纤维化的作用及其机制，阐明ERK5-MEF2信号途径在TGF-β1活化HSC和治疗中的作用，为"活血化瘀"治则防治肝纤维化提供现代理论依据，有助于HSYA成为有潜力的以HSC为靶点的肝纤维化治疗药物，具有重要的科学意义和广阔的应用前景。

本项目研究按计划完成了相关内容，并增加了检测肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）凋亡及相关基因表达的指标。我们采用SD大鼠皮下注射CCl4制备肝纤维化模型。在皮下注射CCl4的同时，腹腔注射羟基红花黄色素A进行干预。采用HE、VG、Masson染色和羟脯氨酸含量评价肝纤维化程度。结果显示，羟基红花黄色素A显著的减少了纤维化肝脏组织胶原纤维沉积，改善损伤的肝脏功能，抑制了纤维化肝脏组织HSC活化，减少纤维化肝组织胶原酶活性，下调α I型胶原、MMP-9和TIMP-1蛋白和mRNA表达，同时也减少了纤维化肝组织TGF-β1水平，抑制Smad4磷酸化。羟基红花黄色素A减少了纤维化肝脏组织Tb-RI、Tb-RII和MEF-2C蛋白和mRNA表达，下调p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白表达，表明羟基红花黄色素A抑制HSC活化涉及ERK5-MEF2C信号通路。羟基红花黄色素A呈剂量和时间依赖性的提高了体外培养的HSC caspase-3活性，显著增加HSC凋亡，PD98059预处理HSC部分废除羟基红花黄色素A诱导HSC凋亡的作用，但对HSC释放LDH和细胞周期没有显著影响。羟基红花黄色素A抑制HSC增殖，抑制了HSC ERK1/2磷酸化，减少HSC Bcl-2蛋白和mRNA表达，增加了Bax蛋白和mRNA表达。羟基红花黄色素A处理HSC显著增加HSC细胞色素c浓度和剪切型caspase-9表达。PD98059预处理废除了羟基红花黄色素A的这些作用。羟基红花黄色素A抑制HSC I型胶原和III型胶原mRNA和蛋白表达，XMD 8-92和羟基红花黄色素A共处理完全废除了羟基红花黄色素A对I型胶原分泌的抑制作用，表明羟基红花黄色素A对HSC I型胶原和III型胶原含量的抑制作用可能涉及ERK5信号通路。羟基红花黄色素A抑制HSC活化，抑制了HSC MEF2C mRNA和蛋白表达和ERK5磷酸化，XMD 8-92和羟基红花黄色素A共处理完全废除了羟基红花黄色素A对α-SMA蛋白的抑制和HSC增殖，表明羟基红花黄色素A抑制HSC活化可能涉及ERK5信号通路。上述结果部分阐明了羟基红花黄色素A治疗肝纤维化的作用机制，为进一步开发羟基红花黄色素A的临床应用提供了药理学依据。通过本项目的研究培养硕士研究生3名，本项目研究结果发表SCI收录的论文3篇。