转录因子SlbZIP38调控番茄果实成熟的分子机理研究

Tomato is a model plant for analysis of fruit ripening research. The molecular mechanism of fruit ripening will provide a valuable reference for improving the quality of tomato breeding program. We have established transcription factor regulatory network of fruit ripening and the transcription factor SlbZIP38 is involved in the fruit ripening related regulatory network interacted with other transcription factors. Compared with the WT, the fruits from SlbZIP38 over-expression transgenic lines are more dark red and ripe earlier. However, the molecular mechanism of SlbZIP38 gene is not clear.In this project, we plan to use the ChIP-Seq to screen the specific DNA binding sequence of SlbZIP38, and to be confirmed by the EMSA. The interaction protein with SlbZIP38 will be detected by the Yeast Two-Hybrid, and the interaction between the SlbZIP38 and the positive proteins will be confirmed by BiFC analysis. The variance analysis of fruits RNA sequencing data between the SlbZIP38 over- expression line and WT tomato will be confirmed by qRT-PCR. The functions of candidate genes will be analyzed through VIGS. Selected the more useful candidate genes to do the further analysis through the over-expression and CRISPR silence transgenic plants. Then the phenotypes related to fruit ripening process will be analyzed to illuminate the function of the candidate genes. The network of the SlbZIP38 gene on regulating the fruit ripening will be established base on the data of this research. Our research work will shed more light on molecular mechanism of SlbZIP38 gene in the regulation of the fruit ripening signal transduction patway in the tomato fruit ripening process.

番茄是研究果实成熟的模式植物，解析其果实成熟的分子机制，对番茄品质改良具有重要的参考价值。在我们建立的番茄转录因子成熟调控网络中，SlbZIP38参与了转录因子之间的相互调控；超表达结果显示，该基因可以调控番茄果实成熟和色泽变化，但其作用机制尚不清楚。本研究拟以SlbZIP38 超表达和沉默株系为材料，利用ChIP-Seq技术，筛选出SlbZIP38的DNA特异结合序列，并通过EMSA验证获得其下游靶标基因；通过酵母双杂交和BiFC技术，鉴别出SlbZIP38的互作蛋白；结合RNA-seq 数据确定候选基因，并采用VIGS筛选效应显著的候选基因进行转基因研究，从生理和分子水平上进行功能鉴定。结合SlbZIP38转基因果实的代谢组差异及SlbZIP38在果实中的表达影响因素，初步建立由SlbZIP38调控的果实成熟信号途径和网络，阐明SlbZIP38调控番茄果实发育成熟的分子机制。

番茄是研究果实成熟的模式植物，解析其果实成熟的分子机制，对番茄品质改良具有重要参考价值。在我们建立的番茄转录因子调控成熟网络中，SlbZIP38参与了转录因子之间的相互调控；超表达SlbZIP38明显影响番茄果实成熟和色泽变化，但其作用机制尚不清楚。本项目围绕番茄SlbZIP38调控果实成熟的分子机制开展研究，主要结果包括：1）本项目利用qRT-PCR技术，以番茄AC++、SlbZIP38 OE和SlbZIP38 Cs为材料，在果实不同发育时期通过外源喷施乙烯、ABA、GA、SA、JA等激素处理，研究不同时期果实中SlbZIP38在外源激素作用后的表达变化；根据叶片对光周期反应，分析光信号对SlbZIP38的影响，明确番茄SlbZIP38在果实发育成熟中的调控因素。2）扩增SlbZIP38的启动子序列，利用YIH技术筛选调控SlbZIP38基因表达的蛋白。3）构建不同时期果实cDNA酵母文库，利用Y2H技术筛选出24个与SlbZIP38互作的蛋白，通过酵母点对点和BiFC实验进行验证，进一步确定与SlbZIP38互作的蛋白。4）在靶基因筛选上，研究方案中拟利用ChIP-Seq技术筛选出SlbZIP38的DNA特异结合序列。但在构建带融合标签GFP的SlbZIP38超表达载体时发现SlbZIP38的三级结构对GFP表达有影响。因此，在研究中实际利用DAP-seq技术筛选SlbZIP38的DNA特异结合序列并取得较好结果，发现SlbZIP38结合位点除ACGT外，还有ACAT。5）结合组学对SlbZIP38 OE和WT不同时期果实进行差异代谢物和差异基因联合分析，初步筛选了SlbZIP38的直接靶标序列，并通过双荧光素酶实验确定了SlbZIP38的直接靶标基因，光调控和成熟相关的基因CPRF2、TGAL12和NOR-Like等。6）本项目鉴定了SlbZIP38的互作蛋白TGA5，并获得由SlbZIP38调控的靶基因CPRF2、TGAL12和NOR-Like等，初步建立了SlbZIP38调控果实成熟的信号途径和网络，明确了SlbZIP38调控番茄果实成熟的分子机制。本研究结果为利用SlbZIP38基因及其所调控的基因来加强果实成熟和耐贮藏等方面的研究奠定了基础。7）通过本项目，共发表论文6篇（第一标注3篇），获权发明专利1项，培养研究生7名（博士2名），优秀本科生4名。