番茄果实成熟相关转录因子SlFRR1的功能分析及调控机理研究

我们利用番茄基因芯片对普通番茄AC++和果实成熟突变体rin、nor及Cnr的转录组进行了比较，并通过人工神经网络（ANN）分析方法建立了番茄果实成熟调控的信号网络模型，发现了大量与番茄果实成熟过程密切相关的特异性转录因子。并克隆了处于ANN信号调控网络核心位置的转录因子SlFRR1基因（图3），定量PCR分析表明，该基因主要在番茄果实成熟期大量表达，病毒诱导瞬时沉默结果显示：SlFRR1基因沉默可延迟番茄果实成熟。本研究拟利用已克隆的番茄SlFRR1基因，构建超表达和RNAi沉默载体，转化番茄，筛选SlFRR1基因超表达和沉默的转基因株系，深入研究该基因的功能；利用随机20碱基二聚体 DNA片段与凝胶移位结合分析技术，研究SlFRR1 蛋白的DNA特异结合域，并利用酵母双杂交技术和荧光共振能量转移法，研究该蛋白与其它蛋白的相互作用，进一步明确SlFRR1蛋白在果实成熟调控中的分子机理。

果实发育和成熟是植物的重要生物学特性，该过程除受到乙烯调控外，同时还受到其他转录因子的调控。本研究通过采用AC++、突变体Cnr、rin和nor的不同发育时期果实的RNA为实验材料，进行了基因芯片分析研究，通过人工神经网络ANN的方法建立了番茄果实成熟的信号调控网络模型，发现SlFRR1基因处于ANN信号调控网络的核心位置，调控其它基因的表达。通过对该基因的功能分析表明：（1）SlFRR1基因在番茄野生型AC++和番茄成熟突变体rin，nor 和Cnr果实不同发育时期的表达模式各不同，很可能参与了果实的发育和成熟（2）番茄果实的瞬时VIGS研究，发现该基因在果实中的沉默会显著地影响番茄果实的成熟；（3）利用已克隆的番茄SlFRR1基因，构建该基因的超表达和RNAi沉默载体，转化番茄AC++，筛选SlFRR1基因超表达和沉默的转基因番茄突变体株系，根据转基因后代的番茄果实的表型观察发现SlFRR1超表达和沉默转基因株系的果实颜色、花瓣维管组织、果实离层等都有显著的表型变化；（4）利用HPLC和共聚焦显微镜等技术分析转基因番茄果实变化的原因，发现转基因番茄叶绿素、番茄红素、类胡萝卜素等与其中果皮内部细胞的叶绿体数目变化成正相关；（5）果实单细胞分离发现，超表达转基因株系中果皮外部细胞的叶绿体明显增大（6）基因芯片和定量PCR分析发现SlFRR1基因对番茄果实成熟相关的基因有一定的影响，SlFRR1基因的超表达和沉默分别显著调控了400余基因的显著变化，这些基因涉及到果实成熟、质体发育、番茄红素合成等相关途径（7）酵母双杂交结果表明SlFRR1蛋白与已知的成熟相关的主要蛋白没有相互作用，有必要在后续工作中对其进行酵母双杂交文库筛选。基于以上研究结果，表明SlFRR1基因在番茄果实成熟过程中，特别是果实颜色变化方面有着重要作用。