APRR2-Like基因调控番茄果实质体分化的分子机理研究

Plastid differentiation is an important characteristic of fruit ripening process. In our previous study, the APRR2-Like gene regulated the development of plastids and the accumulation of lycopene in its over-expression transgenic tomato fruits. But it is not clear on the molecular mechanism of APRR2-Like gene. In this project, we plan to use ChIP-Seq to screen the specific DNA binding sequence of APRR2-Like, and then to confirmed using the EMSA. The interaction protein with APPR2-like will be screened by the yeast two-hybrid. And the interaction between the APRR2-Like and the positive proteins will be confirmed by BiFC analysis. The variance analysis of fruits RNA sequencing data between the APRR2-Like over expression line and WT tomato will be confirmed by qRT-PCR. The functions of candidate genes were analyzed through over-expression and RNAi transgenic research. Then the phenotypes related to fruit plastids differentiation process will be analyzed to illuminate the function of the candidate genes. The network of the APRR2-Like gene on regulating the development of plastids will be established base on the data of this research.The research work will shed more light on molecular mechanism of APRR2-Like gene in the regulation of plastid differentiation signal transduction patway in the tomato fruit ripening process.

质体分化是番茄果实发育、成熟过程中的一个重要变化。前期研究发现，APRR2-Like基因超表达可调控番茄果实质体的分化和番茄红素的积累，但其作用机制尚不清楚。本项目拟利用ChIP-Seq技术，筛选出APRR2-Like的DNA特异结合序列，并通过EMSA验证而进一步鉴别出其作用的靶标基因；拟通过酵母双杂交和BiFC技术，研究APRR2-Like蛋白与其它蛋白的相互作用，鉴别出APRR2-Like蛋白的互作蛋白；结合APRR2-Like超表达果实不同时期的转录组测序及生物信息学分析结果，确定候选目的基因。通过转基因研究，从生理和分子水平上对候选目的基因进行功能鉴定，分析由APRR2-Like基因调控的果实质体分化相关基因在番茄果实质体过程中的生物学功能，初步建立由该基因调控的质体分化相关基因表达的信号途径和网络，阐明APRR2-Like基因调控番茄果实质体分化的分子机制。

质体分化是番茄果实发育、成熟过程中的一个重要变化。前期研究发现，APRR2-Like基因超表达可调控番茄果实质体的分化和番茄红素的积累，但其作用机制尚不清楚。本项目对番茄APRR2-Like基因调控果实质体分化的分子机制开展了相关研究，主要结果包括：（1）本项目构建了果实不同时期的cDNA酵母文库，利用酵母双杂交技术筛选出APRR2-Like蛋白的互作蛋白，并对其互作蛋白进行酵母点对点验证，初步鉴定出14个APRR2-Like蛋白的互作蛋白。（2）通过对APRR2-Like OE和WT的不同时期果实的转录组(RNA-Seq)和代谢组差异分析的结果，初步筛选和确定了部分候选基因。（3）通过对候选基因进行超表达和沉默转基因研究，结合相应的细胞学技术和分子生物学手段，初步确定了候选基因的功能。（4）在靶基因筛选上，研究方案中拟利用染色质免疫共沉淀-测序(ChIP-Seq)技术，筛选出APRR2-Like的DNA特异结合序列。在原计划构建带有融合标签（HA蛋白标签）的基础上，我们增加构建了构建带有融合标签GFP的APRR2-Like基因的超表达载体，并调整了标签的位置，发现APRR2-Like 蛋白的三级结构对融合标签的表达有影响。（5）根据分析APRR2-Like蛋白的互作蛋白基因以及由APRR2-Like基因调控的番茄果实质体分化相关基因超表达和沉默后对番茄果实质体分化的影响，结合转录组和代谢组差异分析结果，发现APRR2-Like受外源激素和光周期的影响，调控一系列光周期和激素相关基因的表达会影响质体发育相关基因的表达。（6）本项目初步建立了由APRR2-Like基因调控的质体分化相关基因表达的信号途径和网络，初步阐明APRR2-Like基因调控番茄果实质体分化的分子机制，并初步确定了APRR2-Like直接与SLOW GREEN1互作，调控R2R3MYB TF、 ERF021等下游基因的信号网络。本研究结果为利用APRR2-Like基因及其调控的基因来增加番茄中番茄红素含量等方面研究奠定了基础。