miR-29调控PD-1甲基化介导HBV免疫逃逸的分子机制研究

Our existing results indicate that over-expression of co-suppression molecule PD-1 was associated with HBV persistence, but the mechanism has not been elucidated yet. One newly proved reason is that over-expression of PD-1 is related to its de-methylation. In consideration of our existing discovery that miR-29 was increased in chronic HBV infection, and that negative regulatory role of miR-29 in infection immunity becomes research hotspot, we speculate that miR-29 induces de-methylation and over-expression of PD-1 by suppress its target gene DNMT, this leads to immune escape of HBV. Our group plans to explore expression level of miR-29, PD-1 and methylation of PD-1 in chronic HBV infection and spontaneous clearance, and hope to confirm our deduction by cell model and shRNA method in vitro. The study expects to reveal that miR-29 could suppress DNMT, induce de-methylation and over-expression of PD-1, results in immune escape of HBV. These research findings have great significance in mechanism and treatment exploration.

课题组前期研究中发现负性分子PD-1的高表达与HBV持续感染有关，但导致PD-1增高的分子机制不明。国内外研究新近证实PD-1的低甲基化是造成其高表达的原因，结合课题组前期发现miR-29在慢性HBV感染者中表达增高的现象，以及目前miR-29在感染免疫中发挥负性调节作用的最新研究热点，推测miR-29通过抑制其靶基因DNMT诱导PD-1的低甲基化和高表达，介导病毒免疫逃逸。课题组以慢性HBV感染者及病毒自发清除者为研究对象，分析其miR-29、PD-1表达及PD-1甲基化情况，并用miR-29模拟物转染细胞及shRNA技术进行体外试验证实推论。项目预期将揭示，miR-29通过抑制甲基化转移酶DNMT，造成负性分子PD-1低甲基化，从而引起负性信号异常活化，诱导宿主免疫耐受和病毒免疫逃逸。项目的研究成果对于研究表观修饰在乙肝病毒免疫逃逸中的作用机制和探索新的治疗方案具有重要意义。

HBV相关肝脏疾病严重危及人类健康，本课题组长期关注T细胞免疫调节机制在HBV感染免疫中的作用，前期发现免疫共抑制分子PD-1在HBV感染者外周血中的高表达诱导宿主的细胞免疫平衡向耐受的方向偏移，可能是造成病毒在体内持续复制和病程迁延进展的主要原因。在前期研究基础上，本课题筛查了慢性HBV感染者与自发清除者的差异miRNA，发现15种miRNA在慢性乙肝组显著高于自发清除组，22种miRNA在慢性乙肝组显著低于自发清除组；采用TargetScan、miRanda、KEGG数据库和GCBI分析软件预测差异miRNA的靶基因，通过GO分析和pathway分析发现了与差异miRNA调控的靶基因最相关的10个信号通路。根据上述生物信息学分析挑选出与HBV感染慢性化有关的差异miRNA，采用RT-PCR法定量检测差异miRNA在两组中的表达情况，发现在慢性HBV感染者中miR-29、miR-34、miR-4485表达显著增高, miR-330-3p、miR-125、miR-1468、miR-3180表达显著降低，提示它们可能是潜在的HBV感染慢性化的分子靶标。通过生物信息学预测软件分析发现DNMT3A的3’UTR区含有miR-29的预测结合位点，同时采用双荧光素酶报告基因检测技术证明miR-29在荧光素酶载体中可以抑制DNMT 3’UTR区的表达。采用亚硫酸氢盐修饰DNA甲基化特异PCR(即MSP法) 分析PD-1的甲基化情况，发现PD-1的甲基化率在慢性乙肝组显著低于自发清除组，并与PD-1的表达水平及miR-29表达水平负相关。. 采用Jurkat细胞和HepG2.2.15细胞共培养的体外试验反映淋巴细胞免疫调节与病毒入侵的肝细胞之间的相互作用效应。分别给予miR-29的过表达和抑制，检测淋巴细胞中CD8+T细胞（CTL细胞）和PD-1的表达水平、PD-1甲基化率及病毒复制情况。明确慢性HBV感染者PD-1的低甲基化是引起PD-1高表达并造成效应T细胞功能耗竭和病毒免疫逃逸的原因之一；阐明miR-29抑制甲基化转移酶DNMT，是引起负性分子PD-1低甲基化和高表达的原因，证实表观遗传修饰参与介导了HBV病毒免疫逃逸的分子机制，相关结果已发表在SCI收录的期刊，为进一步探寻HBV感染慢性化诊治新靶点奠定基础。