磷脂酶A2基因在调控木霉菌诱导玉米抗叶斑病中的作用机理

针对我国普遍发生的玉米三大主要叶斑病，在木霉菌－玉米互作过程中揭示木霉菌分泌型磷脂酶A2（sPLA2）调控木霉菌诱导玉米抗叶斑病的作用机理,为提高木霉菌诱导玉米抗叶斑病的效率提供分子改良靶标基因。研究sPLA2基因对木霉菌生长、产孢和营养利用能力的影响；研究木霉菌sPLA2基因表达与木霉菌产生已知激发子蛋白水平相关性；研究不同玉米自交系遗传背景对木霉菌sPLA2调控玉米抗叶斑病效应的影响；利用激光共聚焦、免疫共沉淀和sPLA2抑制性试验比较野生木霉菌、敲除突变子、互补子及其sPLA2在不同自交系根系皮层细胞中的定位差异，明确木霉菌sPLA2识别玉米根系皮层细胞位点，示踪木霉菌sPLA2影响宿主防御反应信号分子从根系到叶片的转导过程及其相关防御反应基因表达规律；通过蛋白质组学和基因芯片技术检测在病菌胁迫下木霉菌sPLA2调控玉米根系皮层和叶片蛋白网络和基因网络。

本研究在已有工作的基础上,进一步确认该基因的特性。首先重新对磷酯酶A2基因PLA2(PAF-AH)全长序列进行克隆，并采用Neighbour-joining (NJ)构建进化树的方法来对该基因的进化进行分析，发现它与T.virens中的一个Hypothetical protein同源性最高。然后对PAF-AH进行了原核表达并对其活性进行测定，结果表明PAF-AH活性不需要Ca2+,最佳pH为6。利用荧光共聚焦显微镜观察KO 40 PAF-AH: eGFP定位在木霉菌细胞质中，属非分泌型的PLA2基因。利用蛋白质组学技术，比较突变菌株KO 40和原始菌株T30的蛋白质图谱，筛选并鉴定出15个蛋白，其中9个下调蛋白和6个上调蛋白可能参与PAF-AH的调控相关。Real time RT-PCR进一步分析三个下调基因HEX1、Cu/Zn SOD和Cytochrome C，最后表明三基因在mRAN上也是下调。Real time RT-PCR分析挑战接种CX-3后PLA2（PAF-AH）基因对根、茎和叶中JA和SA信号传导的影响。. 试验证实PLA2抑制叶片组织PR1（水杨酸途径相关基因）、OPR7(互作24h和48h)、AOS（茉莉酸途径相关基因）、ACO（乙烯合成基因）和hpl (活性氧相关基因)的表达。本研究明确了PLA２基因对木霉菌Sｍ１激发子的表达有一定的抑制作用，但对Chit42的表达影响不明显。由于研究发现PLA2基因并不能单独对玉米抗弯孢叶斑病菌产生调控作用，因此需进一步筛选木霉菌调控玉米抗弯孢叶斑病的新基因。通过农杆菌介导转化技术构建T30突变株，从突变株中经过活体接种病菌筛选诱导玉米抗性明显变化的突变株，克隆获得一个C6型锌指蛋白基因（称为Tkc6），该基因定位在木霉菌T30的细胞核中。RT-PCR 分析表明：Tkc6抑制根水杨酸（SA）途径关键基因PR1的表达，但上调玉米叶片茉莉酸（JA）途径相关基因OPR7激发子、疏水蛋白Sm1、PR1和乙烯合成相关基因ACO等的表达。 总之，Tkc6基因与PLA2基因对玉米抗性的调控作用具有一定的互补效应，即Tkc6对玉米叶片JA途径OPR7的基因具有正向调控作用，而PLA2在玉米-木霉菌互作后期则负向调控玉米JA信号通路相关基因表达(AOS)。