新型多功能碳纳米管基因传递系统的构建及性能研究

碳纳米管是一种新型的基因载体，具有显著的细胞穿透能力，但直接作为载体使用时，转染效率较低，主要原因包括：体内清除速率较快、对肿瘤细胞没有特异性、与细胞核亲和力不够等；此外，碳纳米管在细胞作用机制、体内分布、细胞摄取和消除动力学方面的研究尚属起步阶段。针对以上问题，申请者率先提出构建以聚乙烯亚胺-碳纳米管（PEI-SWCNTs）为基础，PEG、FA、SV40、PL修饰的具有多重靶向功能的新型基因传递系统，该系统具有长循环、肿瘤部位靶向、细胞核靶向等特点；在此基础上，对碳纳米管的细胞摄取机制、细胞摄取和消除动力学过程等内容进行研究；同时，利用碳纳米管在近红外区的荧光特性，研究载体在活体动物的体内分布情况以及逃逸内吞体降解的机制，目前关于此方面的报道极少。我们希望通过对载体的构建及性能进行系统的研究，为这一新型基因载体的应用研究提供理论基础和实验依据。

近年来，大量的研究致力于开发新型高效的基因载体系统来治疗遗传性或后天性疾病。基因载体系统包括病毒型和非病毒型基因载体，前者易引起机体的系统性毒性，而后者虽具有低免疫原性、易于修饰的优点，却存在内吞体/溶酶体逃逸及核酸释放困难的问题。针对以上这些问题，环境相应型基因载体系统成为一个新的热点，如pH敏感型、磁敏感型、氧化还原敏感型、近红外光敏感型基因载体。其中，近红外光敏感型基因载体系统，包括氧化石墨烯、金纳米粒、普鲁士蓝纳米粒等等，在近红外光作用下，实现更强的细胞内在化能力、内吞体/溶酶体逃逸以及核酸释放，最终获得较强的细胞转染效率。碳纳米管具有近红外吸收以及较强的细胞穿膜能力。申请者率先利用近红外光来实现碳纳米管的光热基因转染研究，通过构建聚烯亚胺胆固醇-碳纳米管（PEI-Chol/SWNTs）的基因载体，研究其核酸结合能力、抗酶降解能力、释放能力等；发现该载体具有光热转换能力、较好的核酸结合及抗酶解能力、近红外光下的体外及胞内促释放性能。在此基础上，作者研究了PEI-Chol/SWNTs的摄取机制及转染效率，发现该载体主要通过小窝蛋白介导的摄取途径进入HEK293及Hela细胞，此途径可避免进入溶酶体，使得内在化后的核酸具有更好的稳定性；该载体具有良好的转染能力，并且在近红外光下，能够获得更高的转染效率。为了研究碳纳米管的光热基因转染在基因治疗方面的可行性，我们通过引入肿瘤凋亡基因TP53，研究了PEI-Chol/SWNTs /TP53对Hela细胞、乳腺癌的抑制能力，发现其能上调P53蛋白水平，引起周期阻滞、线粒体凋亡，且在近红外光辅助下获得更高的抗肿瘤效果。此外，申请者在PEI-Chol/SWNTs基础上，引入了DSPE-PEG来改善前者的生物相容性，获得长循环的新载体PEI-Chol/DSPE-PEG/SWNTs。然而，PEG的引入带来了负面作用——PEG屏蔽效应。“PEG屏蔽效应”显著降低了载体在HEK293细胞中的转染能力。申请者率先利用碳纳米管的近红外光吸收特性，来克服PEG屏蔽效应， 实现核酸的正常释放，获得较好的转染效率。综上，我们希望通过对碳纳米管光热基因转染的研究，来为传统基因载体存在的难题提供一个新的思路与方案。