淋巴细胞白血病CD59 GPI多靶点干预对CBP/LAT微域内移位及跨膜凋亡信号转导的作用研究

Advanced molecular biological information technology and confocal laser are applied to visually dynamic immune observation of the role of CD59 GPI hexadecanoic acid groups in T line leukemia micro domain on adapotor protein CBP/LAT lipid rafts movement and transmembrane apoptosis signal transduction. Phage peptide library is used to screen CD59 gene active sites of tumor escape related and specific short peptide seals are made. The promoting effects of multi-target interventions including CD59 W40 active site,SP1 promoter and hexadecanoic acid groups on the Jurkat leukemia cell apoptosis signal transduction are explored by gene knockout and RNA interference. The mice model with tumor are constructed and 30 cases clinical lymphocytic leukemia patients are selected.The correlation of CD59 and leukemia cells apoptosis are discussed from the genetic and molecular level in vivo. This innovative point is to adopt advanced molecular biology technology to visually dynamic immune observe CD59 GPI active site knockout and the roles of multiple target interventions on joint protein domain shift and transmembrane signal transmission.This study will provide new ideas aim at studying molecular mechanism of CD59 GPI protein transmembrane signal transmission, and provide new targets for the diagnosis and treatment of lymphocyte leukemia.

本研究采用先进分子生物信息技术及激光共聚焦等方法可视动态免疫观测T系白血病细胞微域内CD59类GPI蛋白棕榈酸基团对接头蛋白CBP/LAT脂筏内移位及跨膜凋亡信号转导的作用。利用噬菌体肽库筛选肿瘤逃逸相关CD59活性位点，研制特异短肽封条.通过基因敲除、RNA干扰（RNAi）技术对CD59 W40活性位点、SP1启动子和棕榈酸基团多靶点进行干预，以探讨其对白血病Jurkat细胞跨膜凋亡信号转导的促进作用。构建荷瘤小鼠动物模型并结合30例临床淋巴细胞白血病患者，从基因及分子水平、经体内外实验、多方位探讨CD59与白血病细胞凋亡的相关性。本研究创新之点在于率先采用先进多标分子生物学技术可视动态免疫观测CD59 GPI多靶点干预对接头蛋白微域内移位及跨膜凋亡信号转导的作用，国内外尚未见报道。本研究旨在为CD59类GPI蛋白跨膜信号转导的分子机制提供新思路，并为淋巴细胞白血病的诊治提供新靶标。

本课题组前期研究发现T系白血病细胞CD59分子过表达，并作为协同刺激分子参与T细胞活化信号转导。目前对缺乏胞内段的CD59GPI类锚固蛋白如何发挥跨膜信号转导作用的机制，国内外尚未见报道。我们通过结构分析推测，CD59分子可能通过对LAT和CBP跨膜区的棕榈酰化位点进行酯酰化而招募其进入脂筏发挥信号转导作用。 本研究旨在采用先进分子生物信息技术、RT-PCR、基因芯片、流式细胞术及激光共聚焦等方法可视动态追踪观测T系白血病细胞微域内CD59GPI对接头蛋白LAT/CBP脂筏内移位的作用机制。通过CD59基因敲除、RNA干扰（RNAi）技术及特异配体肽对白血病t细胞CD59进行多靶点干预，以探讨其对白血病Jurkat细胞跨膜信号转导的作用。构建荷瘤小鼠动物模型并结合30例临床淋巴细胞白血病患者进一步经体内外实验、多方位探讨CD59在T系白血病跨膜信号转导中的作用机制。结果表明我们成功将携带有LAT，突变型LAT，CBP，突变型CBP基因的融合蛋白过表达慢病毒载体转染Jurkat细胞，并用CD59单抗刺激后发现：CD59分子的交联能使LAT或CBP在细胞膜上呈点簇状聚集状态，促进LAT介导的细胞活化增殖过程，降低细胞的凋亡信号转导。同时，在CBP组CD59经抗体交联也可以增加CBP对细胞的抑制作用，增加细胞中晚期凋亡率。而棕榈酰化位点突变后，LAT和CBP分子在胞膜中出现一种弥散性分布状态，失去了对细胞的活化和抑制作用。且CD59的交联刺激对突变组的LAT和CBP无明显的效应。结论：棕榈酰化位点是跨膜接头蛋白LAT和CBP进入脂筏发挥作用的必要条件。GPI类锚固蛋白CD59可招募LAT亦或CBP进入脂筏而发挥信号转导功能，促进或抑制T细胞的活化增殖，CD59是一类可发挥双重调节作用的重要蛋白。本研究创新之点在于率先采用先进多标分子生物学技术可视动态免疫观测CD59 GPI多靶点干预对接头蛋白LAT/CBP脂筏微域内移位及跨膜凋亡信号转导的作用机制，并结合裸鼠体内实验及临床T系白血病患者进一步证实。本研究不仅为CD59类GPI蛋白跨膜信号转导的分子机制提供新思路，并为淋巴细胞白血病的基因治疗提供新靶标。具有重要理论意义及临床价值。