聚磷酸盐激酶1在奇异变形杆菌致尿路感染中的作用及其机制研究

Proteus mirabilis belongs to the Tribe Proteae. It is a Gram-negative, facultatively anaerobic, rod shaped bacterium, frequently found in soil, water and the intestinal tract of humans. When this organism, however, enters the urinary tract, wounds, or the lungs it can become pathogenic. Proteus mirabilis commonly causes urinary tract infections (UTI) and the formation of stones. The pathogenesis of urinary tract infections induced by P.Mirabilis still remains largely unknown. Some studies (including our research results published on the Journal of Future Microbiology recently) have suggested that polyphosphate kinase (PPK1) is an important virulence determinant in many pathogens, and exhibits potential to be an attractive target for chemotherapy due to the absence of the PPK1 homologue in mammalian cells. However, the role of PPK1 in the pathogenesis of P.Mirabilis infections is completely unknown. To solve this problem, a ppk1 isogenic in-frame ppk1 deletion mutant of P.Mirabilis strain HI4320 will be constucted and characterized in this study. The adhesion and invasion abilities to the UTI in vitro and in vivo of the mutant will be compared to those of the wild-type strain. Additionally, the effection of ppk1 deletion on the swarming motility and expression of some important virulence factors in P. Mirabilis such as flagella, urease and so on , will also be analyzed. The findings of this study will provied important information for understanding the pathogenesis of UTI induced by P.Mirabilis and .the developing new antibacterial drug.

奇异变形杆菌 (Proteus Mirabilis, P. Mirabilis)属于变形杆菌属，是引起泌尿道感染的重要病原菌之一。研究发现(包括我们已发表的结果)，聚磷酸盐激酶1（Polyphosphate kinase, PPK1）与某些细菌的致病性有重要关系，并参与了多个毒力基因的表达调控，然而它在P. Mirabilis乃至整个变形杆菌属的致病中扮演什么角色，目前还处于未知状态。鉴于以上情况，本项目拟构建P. Mirabilis的ppk1基因缺失株，结合体内、外模型考察ppk1在P. Mirabilis粘附、侵袭尿路上皮组织中的作用，并分析ppk1缺失对细菌群集运动能力及重要毒力因子如鞭毛、尿素酶等表达的影响。通过对上述内容的探索，我们期望明确ppk1是否与P. Mirabilis感染尿路组织相关及其可能的调控机制，从而为阐明P. Mirabilis引发尿路感染的机制打下良好基础。

一、项目背景：奇异变形杆菌是引起泌尿道感染的常见病原菌之一。聚磷酸盐激酶1（PPK1）由聚磷酸盐激酶1基因 (ppk1) 编码，研究发现它与某些细菌致病性有重要关系，且是新型抗菌药物开发的潜在靶位。目前PPK1在奇异变形杆菌乃至整个变形杆菌属致病中的作用尚无任何报道。鉴于上述情况，本项目拟构建奇异变形杆菌的ppk1基因缺失株，结合体、内外模型考察ppk1在奇异变形杆菌粘附、侵袭尿路中的作用，并分析ppk1缺失对细菌重要相关毒力因子如鞭毛、尿素酶，以及与尿路感染密切相关的群集迁移现象的影响。.二、研究内容：（1）构建奇异变形杆菌的ppk1缺失株以及ppk1回补株；（2）对菌株进行基本性质的鉴定，检测野生株、突变株和回补株三者聚磷酸盐含量；（3) 以人膀胱癌上皮细胞5637为体外模型，比较野生株、突变株和回补株三者粘附和侵袭能力的差异；（4） 建立动物感染模型，比较野生株、突变株和回补株在体内的定植能力；取膀胱、肾脏组织切片后作HE染色，观察三者引起病理改变的差异；（5）比较野生株、突变株和回补株三者群集群集迁移能力的差异；（6）比较野生株与突变株相关毒力因子的表达变化。.三、研究结果：1：经PCR、测序及Western blotting鉴定，成功构建了尿路致病性奇异变形杆菌HI4320的ppk1基因缺失株及回补株；ppk1缺失后，奇异变形杆菌合成聚磷酸盐能力下降。2：ppk1缺失株在高热刺激、高渗透压以及过氧化氢培养基中的生存能力明显减弱。3：ppk1失活导致奇异变形杆菌粘附侵袭尿路细胞能力明显下降。4：尿路感染小鼠模型中，ppk1基因缺失株在膀胱组织定植及诱导炎症能力降低。5：ppk1失活导致奇异变形杆菌群集迁移能力减弱。回补ppk1基因后，相关功能表型能够得到回补。6：与野生株相比，ppk1缺失株有7个蛋白表达量下调，分别是TonB依赖受体、应激蛋白G、耐甘露糖样变形杆菌菌毛、热激蛋白、鞭毛加帽蛋白、某种膜蛋白和耐多药外流蛋白，另外有4个蛋白表达量上调：外流蛋白酶、FtsI阻遏蛋白、FKBP肽脯氨酰顺反异构酶和磷酸转移酶。.四、科学意义：本项目证实PPK1作为奇异变形杆菌重要的毒力因子，参与了细菌对环境压力抵抗力、尿路组织侵袭等致病过程，并且可能作为调控子调控奇异变形杆菌多个蛋白的表达，为阐明PPK1在奇异变形杆菌致尿路感染中的作用及靶向药物研发打下了良好基础。