枯草芽孢杆菌不萌发芽孢表面展示粘附因子的构建及其调节仔猪肠道黏膜免疫的研究

Bacillus subtilis has been used widely as a probiotic production for maintaining animal health by improving development of the gut mucosal immunity. However, Bacillus subtilis often confers low immune responses. The reasons of reduced mucosal immune modulation by Bacillus subtilis maybe attribute to the rapidly transit through the gastrointestinal tract and uncontrollable germination of Bacillus subtilis spore in the gastrointestinal tract. To improve the performance of B. subtilis on the gut mucosal immunity, based on B. subtilis electroporation method developed in this laboratory the selection-marker-free Bacillus subtilis recombinant conferred germination-defective spore will be constructed to.investigate its’ effect on the mucosal immunity in this study. Then, three adhesins (S-layer protein from Lactobacillus brevis, invasion of Yersinia pseudotuberculosis and Fc of IgG) would be genetically fused with CotB, a B. subtilis spore coat, and expressed at the spore surface. The resultant spores displaying adhesins will be employed to probe the ability of adhesion, immune modulation and prevention of animal against pathogens attack. In conclusion, this work will reveal the function and the modulation pathway of spore in gut mucosal immunity, and further provide new idea and approach for the development of potential B. subtilis to reduce the diarrhea rate and mortality of piglets, which will greatly promote the healthy development of swine industry in China.

枯草芽孢杆菌作为益生菌可有效促进新生动物肠道免疫系统的发育成熟，提高动物自身抵抗力。但由于枯草芽孢杆菌存在芽孢萌发不可控及肠道停留时间短两大问题，造成其免疫调节效果不够理想。为突破该瓶颈，本项目在已建立的枯草芽孢杆菌电转化整合技术的基础上，构建无抗性标记的不萌发芽孢突变株，研究该突变株对仔猪肠道免疫功能的调节作用。并进一步在突变株芽孢表面展示S-layer蛋白、Invasin和IgG1 Fc等三种粘附因子，构建不同粘附类型（广谱型、M细胞靶向型、FcRn+/ FcγR+细胞靶向型）的重组芽孢，检测其粘附能力、肠道免疫调节能力及抑菌能力。通过本项目的实施，探究芽孢及表面展示粘附因子的重组菌在仔猪肠道黏膜免疫中的作用及调节机制，培育具有高免疫调节活性的重组菌。从而为枯草芽孢杆菌在肠道免疫调节中的高效应用提供新的思路和工具，这对于降低仔猪腹泻率和死亡率，促进养殖业健康发展有重要意义。

本项目分别研究了枯草芽孢杆菌营养体和芽孢对仔猪肠道免疫功能的调节作用，解析了芽孢孢壳蛋白在免疫调节中的作用。采用不同策略在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示S-layer蛋白，检测了其粘附能力和肠道免疫调节能力。通过本项目的实施，剖析了芽孢在仔猪肠道黏膜免疫中的作用及调节机制，通过芽孢表面展示粘附因子提高了枯草芽孢杆菌的肠道免疫调节活性，从而为枯草芽孢杆菌在肠道免疫调节中的高效应用提供新的思路和工具。.本项目成功构建了1株枯草芽孢杆菌芽孢不萌发突变株、1株不生孢突变株和6株孢壳蛋白缺失突变株。突变株对促炎和抑炎因子具有调节作用，可显著的改变了IL-6、IL-β等TNF-α细胞因子的分泌，枯草芽孢杆菌的5个孢壳蛋白均可以可以被TLR4识别，依赖MyD88信号通路发挥免疫调节作用。枯草芽孢杆菌营养体能分泌胞外囊泡（粒径峰值85 nm），其可以显著升高胞内ACP、LDH和iNOS活性，提高促炎性细胞因子的分泌量。并且，枯草芽孢杆菌的胞外囊泡可以携带重组菌的外源蛋白。.系统比较了锚定蛋白和展示位点对表面展示效果影响。锚定蛋白CotZ和原位或异位整合可以实现芽孢表面展示。为优化芽孢表面S层蛋白的展示，对S层蛋白供体菌Lactobacillus进行了S层的蛋白质谱分析，并通过供体菌的基因组测序分析，发现了一个新的高产量和高自主装的S层蛋白（Orf00226）。分别克隆Orf00226编码基因构建了CotZ-Orf00226芽孢表面展示，同时利用该S层蛋白自组装的特性建立了一套新的S层自组装芽孢表面展示系统。S层自组装芽孢表面展示系统效果优于CotZ-Orf00226芽孢表面展示，其表面组装的S层蛋白量远远大于后者。粘附效果和生物位的竞争结果表明，S层自组装芽孢表面展示显著提高了芽孢的粘附和对致病性大肠杆菌的排斥，对于固有免疫有显著的调节作用。.本项目发现孢壳蛋白是重要的调节效应物，胞外囊泡是营养体的递送体。获得一个优良的粘附因子--S 层蛋白，并建立了新的S自组装芽孢表面展示系统，开拓了一个新的表面展示应用的方向，可以在微米级生物体亦可以在纳米级的生物体促进粘附或靶向。