人工饲用纤维素酶多酶复合体重组枯草芽孢杆菌的研究

For improving utilization of fiber and exploiting the feed resource, we will developed the engineering cellulosomal Bacillus subtilis in this project. To construct the the cellulase gene and xylanse gene containning dockerine module, the coding genes of cen6, cex6, bg6 and xyn will be employed to link with the coding gene of type I dockerin module, resulting cen6dR、cex6dC、bg6 and xyndB. Meanwhile, the coding genes of scaffoldin will be assembled by coding gene of cohesin module and cabohydrate binding module. The strong promoter will be cloned by using of promoter-trapping system, and high-level expression system will be developed by the resultant strong promoter in Bacillus subtilis. Through high-level expression of cen6dR、cex6dC、bg6dA, xyndB and coding genes of scaffoldin, three engineered designer cellolusome will be obtained. The cellulase-cellulase and cellulase-xylanase synergy will be investigated. Thus, this would provide an efficient engineering cellulosomal Bacillus subtilis and a potential method and approach for efficient utilization of fiber.

为了建立有效的饲用木质纤维素酶系协同作用的技术体系，提高粗纤维的降解率，缓解饲料资源紧张的现状，本项目拟以课题组前期克隆的高活性纤维素外切酶基因(cen6)、内切酶基因(cex6)、纤维二糖酶基因(bg6)和木聚糖酶基因(xyn)为元件，构建含有锚定域的重组纤维素酶基因，并利用来源于厌氧微生物的粘附域基因进行脚手架蛋白基因的人工设计和构建；利用课题组前期建立的探测载体pShuttle筛选强启动子，构建枯草芽孢杆菌高效表达系统，对得到的重组纤维素酶基因和脚手架蛋白基因进行表达，锚定域和粘附域的特异性结合，介导组装纤维素酶多酶复合体，通过其在物理空间上的协同作用，有效降解木质纤维素。通过本项目的实施，建立一套枯草芽孢杆菌纤维素酶多酶复合体的高表达系统，研究和筛选纤维素酶系成员之间，以及它们与木聚糖酶之间的协同作用效果，以提高粗纤维的降解率，从而为饲用纤维素的高效利用提供新的理论依据和技术体系。

为了建立有效的饲用木质纤维素酶系协同作用的技术体系，提高粗纤维的降解率，缓解饲料资源紧张的现状，本项目以纤维素外切酶基因、内切酶基因、纤维二糖酶基因和木聚糖酶基因等为元件，构建含有锚定域的重组纤维素酶基因，并利用来源于厌氧微生物的粘附域基因进行脚手架蛋白基因的人工设计和构建；利用启动子探测载体pShuttle筛选强启动子，构建枯草芽孢杆菌高效表达系统，对得到的重组纤维素酶基因和脚手架蛋白基因进行表达，锚定域和粘附域的特异性结合，介导组装纤维素酶多酶复合体，通过其在物理空间上的协同作用，有效降解木质纤维素。通过本项目的实施，建立一套枯草芽孢杆菌纤维素酶多酶复合体的高表达系统，提高粗纤维的降解率，从而为饲用纤维素的高效利用提供新的理论依据和技术体系。项目研究结果如下：.构建了新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pPS-1，采用嗜热芽孢杆菌β-半乳糖苷酶基因（bgaB）为报告基因，以pPS-1为质粒骨架构建枯草芽孢杆菌启动子筛选载体pShuttle-2。获得11个酶活高于5000Mill U/mL的克隆。依次命名Pv-1至Pv-11。将Pv-1至Pv-11提取质粒，转化枯草芽孢杆菌，测定酶活。获得5个高活性启动子片段Pv-3、Pv-4、Pv-6、Pv-8、Pv-9，其活性依次为4670 Mill U/mL，6433 Mill U/mL, 4569 Mill U/mL,7457 Mill U/mL,5987 U/mL。.成功构建含type I锚定域的4种重组木质纤维素酶基因cen6dR、cex6dC、bg6dA和xyndB，以及含有相应的粘附域的脚手架蛋白编码基因。构建枯草芽孢杆菌表达载体，实现了重组蛋白的表达。以单晶纤维素为底物检测重组表达的纤维素酶活性，结果显示均有降解活性，多酶复合体活性显著高于游离酶。以麸皮为底物，结果与预期一致。.项目结果表明，游离酶通过锚定域与含有粘附域的脚手架蛋白结合形成纤维素酶多酶复合体。该纤维素酶多酶复合体能够使纤维素酶具有协同作用的酶在空间上靠的更近，另外，通过脚手架蛋白上的纤维素结合域 CBM 使整个纤维素酶多酶复合体与底物的接近程度提高，从而进一步提高降解纤维素的效率。.利用锚定蛋白模块和粘连蛋白模块之间的特异性相互作用能够将所需要协同作用的酶或者非酶组分组合成特定的纤维素酶多酶纤维素体，这种技术策略对木质纤维的降解具有很大的生