基于分子水平调控枯草芽孢杆菌芽孢表面高效稳定展示海藻糖合酶体系研究

Trehalose is a stability and safety protection of biological product and has widely application prospect.The production method of converting maltose into trehalose by trehalose synthase using one-step has the advantage of simple process with the practical significance of industrial production.This project aims to establish a High efficience and stable Bacillus subtilis spore surface display system to overcome exocytosis difficulty and poor stability of trehalose synthase, to save the crushing and seperation cost caused by intracellular expression ,to reduce the heat source material.The research contents include to explore the key receptor protein and the mechanism corresponding to spore germination factors using gene knockout technology by analysis of the factors leading to spore germination in the conversion system of maltose into trehalose to achieve the spore surface stability display of trehalose synthase in conversion system; To clone the spore coat protein gene and green fluorescent protein gene by molecular biology techniques. Single or cross display fluorescent protein fusion to spore coat protein on the spore surface, the optimal display mode is used for trehalose synthase spore surface display, and to explore enzymatic propertiesof trehalose synthase;Using semi rational design strategies to analyze and transform amino acid compositionof trehalose synthase, and to achieve acid resistance of surface stability display trehalose synthase in conversion system.

海藻糖是一种稳定的、安全的生物制品保护剂，应用前景广泛。利用海藻糖合酶一步转化麦芽糖生产海藻糖的方法具有工艺简单，符合工业化生产的现实意义。本项目拟建立一个枯草芽孢杆菌芽孢表面高效稳定展示海藻糖合酶体系，克服海藻糖合酶胞外分泌困难且稳定性差的弊端，降低因胞内表达而徒增的细胞破碎和分离成本，并减少了热源物质的残留。研究内容包括，通过分析麦芽糖制备海藻糖转化体系中诱使芽孢萌发因素，结合基因敲除技术敲除与主要诱导因素相对应的关键受体蛋白基因，实现表面展示海藻糖合酶的芽孢特征的稳定，并探究作用机理；利用分子生物学技术克隆芽孢衣壳蛋白基因，单一或交叉融合绿色荧光蛋白展示于芽孢表面，以最大荧光强度展示组合高效展示海藻糖合酶，分析酶学特性，并利用半理性设计策略改造海藻糖合酶氨基酸组成，加强转化体系中芽孢表面展示海藻糖合酶的耐酸性。

海藻糖具有逆性环境下保护生物大分子生命体特征的生物学功能。海藻糖合酶（TreS）能将麦芽糖一步异构为海藻糖。生产中，TreS通过重组大肠杆菌胞内表达，高压均质破碎细胞取酶过程复杂，产品中内毒素超标，且与以淀粉底物的双酶法比较，海藻糖生成率不占优势。针对上述问题，本项目开展了以下研究工作：.1.利用I-TASSER服务器和AUTODOCK软件分析了来源于Pseudomonas putida P06的TreS三维结构及其与麦芽糖的分子对接情况，结合NCBI数据库中的500种TreS的Blast序列对比结果，选出TreS活性中心周围4~8 Å范围内的232D、407V、490K三个氨基酸位点进行饱和突变，获得转化率显著提高的突变TreS（V407M/K490L），转化率较原始TreS提高了11.9%；选取TreS（V407M/K490L）表面碱性氨基酸19K、46R、81K、82R、137R、583K、680R突变为酸性谷氨酸（E），获得转化率提高和耐酸性增强的突变TreS（V407M/K490L/R680E）。.2.流式细胞仪分析芽孢表面cot系列锚定蛋白展示EGFP的荧光通量大小依次为CotX>CotY>CotF>CotC>CotE>CotG>CotV>CotB>CotM>CotA>CotW。选取CotC和CotG独立或共展示TreS于枯草芽孢表面。荧光共聚焦、Western blot、Dot blot及酶活性分析表明双Cot共展示TreS的酶活高于单Cot展示TreS的酶活之和。因此构建了由CotX，CotY，CotF，CotC和CotE共展示TreS的重组芽孢，单位干重芽孢酶活达到12521.32 U/g。敲除了影响芽孢萌发的关键基因 sleB和cwlJ后，芽孢的萌发得到显著抑制。.3.以pHT01为表达载体，PsrfA、P43和PabrB-spoVG-LytC-mmgA为启动子，phoD和YwbN为分泌信号肽，构建了分泌表达TreS的重组枯草芽孢杆菌，分析表明P43启动子和phoD信号肽更有利于TreS的分泌。敲除了重组菌种裂解关键基因SkfA、Sdpc、LytC和Xpf，5 L发酵罐中，发酵32h，胞外酶活达34980.58 U/L。.4.探讨了发酵耦合转化制备海藻糖技术，发酵液中的海藻糖含量达到初始麦芽糖含量的74.6%。