基于siRNA文库筛选的膀胱癌生物治疗的细胞和分子机制研究

膀胱癌是泌尿外科最常见的肿瘤。膀胱癌siRNA药物治疗关键在基因有效性序列选择和体内应用靶向性。研究前期成功构建siRNA文库，联合原位膀胱癌动物模型用于siRNA药物筛选。因而，我们假设肿瘤细胞与同一病人的正常细胞的差异表达基因是影响肿瘤细胞表型和功能的关键，联合siRNA文库筛选和原位膀胱癌动物模型筛选和验证，可发现对膀胱癌治疗有效的siRNA。为此，本研究：①利用临床样本，激光显微切割，分离膀胱癌细胞和同一病人的正常膀胱上皮细胞，cDNA芯片检测差异表达基因。②建立筛选出的差异表达基因的siRNA文库，转染同一病人的原代培养肿瘤细胞，获得影响表型改变的最佳siRNA序列。③联合原位膀胱癌动物模型筛选和验证。④趋化因子CCL2抗体片段偶联的siRNA靶向治疗人膀胱癌的裸鼠移植瘤模型。目标是发现新的治疗膀胱癌的siRNA药物，提高靶向性。意义在于阐明差异表达基因功能和发现siRNA药物。

膀胱癌是全世界发病率和死亡率的一个主要原因。虽然局部膀胱癌可以通过手术切除，其复发和进展率仍然很高；放疗或化疗治疗晚期膀胱癌的效果仍不能令人满意，有待于进一步研究膀胱癌发生发展的分子机制和寻找新的有效的治疗靶点。本研究中，我们选取6对膀胱癌肿瘤组织及其癌旁正常膀胱黏膜，进行了全基因表达谱芯片分析；结合疾病关键基因数据库进行了生物信息学分析，筛选得到待研的差异高表达基因32个，并针对其进行了siRNA文库构建和高通量HCS筛选，初步找到了3个对膀胱癌细胞生物学行为改变有意义的基因，分别是CCDC34、UBE2T和HIST1H3H，并进行了相关细胞功能实验及其机制研究。.卷曲螺旋结构域蛋白具有许多重要的生物学功能，如调控基因表达，细胞分裂，膜融合等；其表达的异常，与肿瘤细胞侵袭、迁移和转移表性的获得有着直接的关系。CCDC34，也被称为肾癌抗原NY-REN-41，是蛋白质编码和疾病相关的基因。本研究发现，CCDC34在膀胱癌细胞和组织中均高表达；它定位于胞浆，其表达水平与年龄、性别、病理组织学类型和组织学分级无关，而与临床分期有关。敲低膀胱癌细胞中CCDC34基因的表达，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，细胞凋亡增加，并诱导细胞周期阻滞于G2/M期。体外实验中，将经过人工特异化学修饰合成的CCDC34 siRNA分子直接注入裸鼠移植瘤中，发现肿瘤生长延缓。同时CCDC34的敲低抑制了MAPK和AKT信号通路的激活，磷酸化的MEK、ERK1/2、JNK、p38 和Akt水平降低，c-Raf、c-Jun和Bcl-2的表达降低，提示CCDC34可能通过MAPK和AKT信号通路参与了对膀胱癌细胞生长、迁移和侵袭的调控。.泛素融合酶E2T，是泛素蛋白酶体途径中泛素融合酶E2家族中的一员，在许多肿瘤中高表达，且在范可尼贫血信号通路中具有重要作用。本研究发现，UBE2T同样在膀胱癌组织和细胞中高表达；敲低UBE2T的表达后，显著抑制了肿瘤细胞的增殖和克隆形成，细胞凋亡增加，且诱导细胞周期阻滞于G2/M期；提示UBE2T在膀胱癌细胞增殖中具有重要作用。.综上，CCDC34和UBE2T可能是参与膀胱癌形成和进展的重要候选癌基因，有望成为膀胱癌的生物标记物和临床治疗的潜在新靶点。在后续研究中，我们将深入探索CCDC34/UBE2T的临床相关性和在膀胱癌发生、进展过程中的具体作用机制。