玉米抗丝黑穗病候选基因cDNA全长克隆及功能分析

Head smut caused by Sporisorium reilianum f. sp. zeae (Kühn) is an important disease in maize. A number of studies evidenced that the behavior of head smut resistance in maize belonged to quantitative trait controlled by many loci. A major QTL HSQ2.09 has been mapped on maize chromosome 2 (bin 2.09), and several linked markers have been developed in this region. Currently, we have developed the near-isogenic line (NIL) carrying HSQ2.09 by backcrossing combined with MAS from donor line Qi319 into the Huangzao4 genetic background. In this project,the expression pattern of resistance candicate genes will be studied using Real-time PCR technique and the NIL and Huangzao4 incoculated by needle puncturing method. Furthermore, the full-length cDNA encoding head smut resistance candidate gene will be cloned via RACE, and structural characters wil be analysed using a bioinformatic. The fuction of the resistance gene will be validated by using prokaryotic expression in vivo and transgenic technique. The purpose of this project is to clone the gene, and reveal the disease-resistant mechanism of head smut in mazie.

玉米丝黑穗病是由丝轴黑粉菌引发的一种绝产性病害，其抗性受多个数量性状位点控制，在染色体2.09区域已检测到主效抗性位点HSQ2.09，并开发出紧密连锁标记。本项目前期通过生物信息学手段预测出该位点的抗性候选基因，并创造了以高感丝黑穗病玉米自交系黄早四为遗传背景，齐319为供体含主效抗性基因HSQ2.09的近等基因系L282。本研究拟以抗病近等基因系与黄早四为材料，采用丝轴黑粉菌混合交配型菌液针刺茎基部接种技术，通过Real-time PCR技术研究抗玉米丝黑穗病基因HSQ2.09的表达模式；结合RACE技术克隆抗病候选基因全长cDNA序列，对其进行生物信息学分析；在通过体外抑菌实验分析抗病性基础上，构建过量表达载体，转化高感玉米自交系黄早四，验证基因功能，进而阐明玉米抗丝黑穗病基因作用的分子机理。本项目研究结果有助于丰富玉米抗病遗传基础。

丝黑穗病是由丝轴黑粉菌引发的一种玉米绝产性病害。本研究参照玉米B73全基因组序列在抗丝黑穗病主效位点区域预测到1个抗病候选基因，命名为ZmNL；以高感丝黑穗病玉米自交系黄早四及以齐319为供体含抗病相关主效QTLqHS2.09的近等基因系L282为材料，采用丝轴黑粉菌混合交配型菌液针刺茎基部接种方法，经Real-time PCR检测发现L282和黄早四在接种前后ZmNL基因的表达量存在极显著差异，接种后第2d时达到峰值，抗病材料中基因相对表达量（4.29）极显著高于感病材料（2.99），之后表达量呈下降趋势，说明该基因的表达受丝轴黑粉菌的诱导；利用RACE技术结合RT-PCR，从玉米抗病近等基因系L282中克隆了ZmNL基因全长cDNA序列，并在Genebank中注册（登录号为KF765443），全长为3572bp，包含3156bp的开放阅读框、163bp的 5′-UTR区和253bp的3′-UTR区；生物信息学分析表明，ZmNL蛋白序列内具有NBS、LRR等抗病保守结构域，属于CC-NBS-LRR类的R蛋白；构建基因原核表达载体pET32a(+)-ZmNL转化大肠杆菌诱导蛋白表达，体外抑菌试验表明丝轴黑粉菌的生长受到ZmNL蛋白抑制；将该基因采用农杆菌侵染萌动胚和侵染幼胚的方法转入高感自交系黄早四和HiII，获得3个以单拷贝或双拷贝整合的遗传稳定的T2代转基因株系，田间人工接种后丝黑穗病发病率与对照相比降低了18.38%-29.40%，达到显著水平，说明ZmNL基因是一个重要的玉米丝黑穗病抗性相关基因，其结果对于阐释玉米抗丝黑穗病的分子机制具有重要意义。.发表论文5篇，其中SCI收录3篇，获得授权发明专利2项，培养博士研究生1名，硕士研究生1名。