海洋假单胞来源海藻糖合成酶热稳定性和无葡萄糖副产物特性的结构基础研究

海藻糖有广泛的应用价值。海藻糖合酶（TreS）途径是酶法转化生产海藻糖的主要途径，但现有TreS酶存在热稳定性差、酶最适温度低和副产物葡萄糖形成的缺陷，使海藻糖的生产成本过高。本课题组在前期工作中发现一海洋假单胞菌（P8005）来源的TreS。酶学性质发现，该酶最适温度较高，热稳定性好，高温下不产生葡萄糖。本项目旨在研究与该TreS无副产物葡萄糖、热稳定性好与其结构的相互关系。在获得P8005 TreS合酶一级结构的基础上通过同源建模获得其模拟的三维结构。通过和酶学性质已知的几种TreS合酶进行一级结构及模拟三维结构的比较，分析耐高温及高温下无副产物产生的结构原因，并进一步通过突变酶实验验证。本研究对阐明TreS副产物葡萄糖产生及热稳定性的结构基础具有理论意义、为TreS合酶酶学性质优化的蛋白质工程改造提供理论依据，对降低海藻糖生产成本具有重要的实践意义。

本项目研究中我们从海洋假单胞菌P8005筛选获得了两个新型海藻糖合酶基因g526和g649,对这两个基因进行克隆表达、蛋白质纯化。对重组蛋白G526和G649进行酶学性质研究、酶的结构模拟、结构与功能关系等多方面研究，阐明了与G526中参与底物结合及副产物形成的重要的结构基础，同时也阐明了与G649副产物葡萄糖少以及热稳定性较好的结构基础。本研究为新型海藻糖合酶G526与G649的酶学性质优化及应用提供了理论依据。主要研究结果如下：.1、从P8005菌株中获得两个海藻糖合酶的编码基因g526和g649，g526基因序列已提交Genebank（登录号：JQ951963）。.2、构建了g526和g649基因的原核表达载体，优化重组表达及蛋白纯化条件，获得纯化的G526蛋白和G649蛋白，纯度大于95%。获得的重组蛋白能将麦芽糖转化为海藻糖。.3、对G526进行酶学性质研究 发现其对底物麦芽糖转化率很高（72%），并且其生成的副产物葡萄糖含量较少(经12h反应至平衡点小于5%)。.4、对G649开展酶学性质研究，发现G649具有很高的催化效率（kcat/Km 为2600mol-1/s-1），并且其副产物葡萄糖的量非常低（经12h反应至平衡点小于1%）。此外，G649 在中性pH条件下热稳定性也较好。 .5、G526 N端的结构域以同源建模获得模拟结构。结构分析、定点突变、酶学性质研究表明G526中以下残基与底物结合及副产物葡萄糖形成相关：D78，Y81，H121，D219，E261， H331，D332，R414。同位素底物标记实验表明G526在催化麦芽糖和海藻糖相互转化过程中采用分子内机制。.6、基于多重序列比对及折叠识别G649获得的模拟结构具有高的可信度分值（100%）。通过分子对接，获得G649与底物麦芽糖、产物海藻糖及副产物葡萄糖相互作用的信息。结构模拟与分析表明： G649活性中心的形状不利于水分子进入活性中心内部，从而不容易形成副产物葡萄糖。此外，结构分析结合定点突变表明，G649中以下残基与底物结合与催化、副产物葡萄糖的形成相关：D112 F115 E257 D294 Q337。.