海藻糖合酶结构解析及其活性和热稳定性改造的研究

Trehalose synthase is one kind of intramolecular glucoside transferase, which only needs one step to transfer α-1,4 glycosidic bonds of maltose into trehalose α-1,1 glycosidic bonds. So it has good application prospect. Natural trehalose synthase has defects such as low enzyme activity and poor thermal stability. It is difficult to be apllied in in industry. Up to now, there are several reports to improve the enzyme activity through molecular modification. But there is no report about the structure analysis and rational design. In the project we research the crystallography of trehalose synthase from Pseudomonas putida (As 1.1003) with x-ray diffraction method. On the base of the three-dimensional structure, we use molecular simulation, sequence structural analysis and molecular experiment to study its activity site, catalysis site and structure stable domain. Next, we use site-directed mutagenesis to improve the conversion rate and the stability of enzyme activity. Through this project we will provide the foundation of industrialized production.

海藻糖合酶（Trehalose synthase）是将麦芽糖α-1,4糖苷键异构为α-1,1糖苷键生成海藻糖的分子内葡糖苷转移酶，工业上有良好的应用前景。天然的海藻糖合酶大都具有酶活力低以及热稳定性差等缺陷，无法工业化应用。目前虽有采用同源模拟定向进化技术对其进行分子改造的报道，但由于缺乏海藻糖合酶三维晶体结构的报道，因此在结构层面缺乏精确分析的模板。本申请以具有良好工作基础的恶臭假单胞菌海藻糖合酶作为研究对象，运用X射线晶体学的方法测定海藻糖合酶的三维结构，同时结合序列比对分析、分子对接、分子动力学模拟以及分子生物学实验等方法系统地分析其活性中心、催化位点、结构稳定功能域等关键功能域的精细结构。对关键位点采用定点突变技术筛选催化活力和热稳定性提高的突变酶。这将为深入理解海藻糖合酶的催化反应机制以及酶蛋白的分子改良提供指导，具有重要的理论意义和实际应用前景。

海藻糖合酶（Trehalose synthase）是将麦芽糖α-1,4糖苷键异构为α-1,1糖苷键生成海藻糖 的分子内葡糖苷转移酶，工业上有良好的应用前景。天然的海藻糖合酶大都具有酶活力低以及热稳定性差等缺陷，无法工业化应用。目前虽有采用同源模拟定向进化技术对其进行分子改造 的报道，但由于缺乏海藻糖合酶三维晶体结构的报道，因此在结构层面缺乏精确分析的模板。本申请首次解析了嗜热菌Thermobaculum terrenum海藻糖合酶(TtTS)的三维结构，同时结合序列比对分析、分子动力学模拟等方法系统地阐明了该酶的耐热机制，为耐热酶的进一步的利用以及海藻糖合酶分子的耐热改造奠定了理论基础。TtTS 具有典型的糖苷水解酶13家族酶的三维结构，其活性中心是典型的Asp202-Glu244-Asp310催化三联体，然而TtTS具有明显的耐热性。另外，本项目以该酶的三维结构为基础，结合生物信息学的方法系统地研究了该酶的底物进出通道，并采用饱和突变的方法对关键位点（K136,137Y,138K,139D,140A,145I,149R）进行定点突变，筛选获得了催化活力提高的突变酶。这将为深入理解海藻糖合酶的催化反应机制以及酶蛋白的分子改良提供指导，具有重要的理论意义和实际应用前景。本项目执行期间，共发表SCI论文3篇，EI论文1篇，申请专利4项，授权2项。