利用基因芯片进行检疫实蝇的高通量快速鉴定

检疫实蝇一般截获非成虫期为主，但非成虫期及近似种因形态接近很难鉴定。本研究通过40余种检疫实蝇亲缘关系分析，选择不同基因标记寻找种间序列差异，如mtDNA或核内ITS等基因标记，尤其是对桔小实蝇复合种(杨桃实蝇、芒果实蝇、木瓜实蝇、菲律宾实蝇、斯里兰卡实蝇等)及其近似种则进行mtDNA全序列比对，寻找实蝇种间在核苷酸序列上的稳定SNP差异位点，设计特异探针并利用基因芯片技术进行种类鉴定。可以解决长期以来依赖成虫形态学特征鉴定导致种间差异不确定和鉴定周期长甚至无法鉴定的问题，实现利用检疫截获的非成虫期、或残缺的少量实蝇样本，达到高通量、快速、准确鉴定实蝇种类的目的。上述实蝇种类的精确鉴定，对区分土著种和外来入侵种、风险及入侵路径分析等可提供重要的证据。同时，为探讨研制重要实蝇种类广谱性基因芯片筛查技术打下坚实基础，为上述实蝇害虫的防治和检疫争端的解决提供技术支持，促进我国果蔬农产品出口。

检疫实蝇一般截获非成虫期为主，但非成虫期及近似种因形态接近很难鉴定。本研究通过40余种检疫实蝇亲缘关系分析，选择不同基因标记寻找种间序列差异，如线粒体标记mtDNA分别建立了COI和COII为标记的系统发育关系，结果说明该区域能够提供的实蝇种类的DNA序列信息是最多的。该片段包括线粒体细胞色素氧化酶I (COI)大部分和部分COII，COI提供的信息量最大，其次是COII。利用DNA条形码为鉴定实蝇疑问种类提供了利器，可用该技术将重要的检疫性实蝇种类从本地不太受关注的实蝇种类中区分出来。.获得主要检疫实蝇47种的线粒体COI的2个片段、COII一个片段，每个片段约650-790bp不等的序列共计约300条，利用这些标记对样品进行系统发育分析，结果表明3个片段均可用作DNA条形码对实蝇进行分子快速鉴定。40种能清晰鉴定出来，但DNA条码还无法解决例如橘小实蝇、昆士兰实蝇等复合种区分问题。利用COI和COII标记对截获到地中海实蝇的地理种群遗传差异进行了分析，地中海实蝇形成两大分支。一个是以地中海沿岸国家为主的一个区域，意大利、希腊、黎巴嫩、约旦、埃及等国。这是地中海实蝇发生危害最普遍的地区，也是该虫种名的由来所在，暂称之为地中海区域分支。地中海实蝇的另一个分布中心是西非为主的多个非洲国家：如科特迪瓦、加纳、多哥、贝宁、尼日利亚、刚果等，它们本身是彼此相邻，形成了地中海实蝇的一个分布区域，暂称之为西非区分支。.通过不同种类序列的比对，寻找实蝇种间在核苷酸序列上的稳定SNP差异位点进行探针设计。本研究共设计了47种检疫性性实蝇的基因芯片鉴定探针约100条。阳性样品29种如具条实蝇、瓜实蝇等。阴性对照实蝇和其他昆虫11种：如小南瓜实蝇、海岛实蝇、三叶草斑潜叶蝇、刺桐小蜂、寄蝇Sarcophaga penicillata和溪沟按蚊Anopheles fluviatilis等。探针已设计并合成但缺少实蝇样品进行验证的种类共18种：如C. flexuosa、番茄实蝇、黑翅凤实蝇、D. armatus、单带实蝇、香蕉实蝇、新喀里多尼亚实蝇等。33种探针有样品进行芯片鉴定验证，探针适用的共23个，它们分别是：地中海实蝇C. capitata、非洲芒果实蝇、 C. cosyra、葫芦寡鬃实蝇、入侵果实蝇、斯里兰卡实蝇、蜜柑大实蝇等。6个探针无杂交或不稳定，分别是：桔小实蝇、菲律宾实