出血性血小板病iRhom2基因研究及益气活血方的治疗作用

Hemorrhagic thrombopathy (HT) is considered as a group of hemorrhagic diseases characterized by dysfunction of platelet aggregation. Yiqi Huoxue Fomula is effective for HT, but the mechanism remains unclear.Previously, we found that the expression of platelet membrane glycoprotein (GP) Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ and its subunit GPⅠbα, which serve as a co-receptor of von willebr and factor and thrombin, is downregulated. The main reason is that abnormal regulation of ADAM17, leading to over hydrolysis of GPIbαand GPⅤ in the extracellular segment, thus resulting in platelet aggregation dysfunction in HT. Present research shows that iRhom2, which serve as the upstream molecular chaperone of the ADAM17, is the key gene for ADAM17 translocation and protein hydrolysis. The first iRhom2 directly binds with pro-ADAM17 in the endoplasmic reticulum, and then is modified into the mature ADAM17 in the Golgi, finally the mature ADAM17 is localized to cell membrane, and performs the function of protein hydrolysis. Therefore, we attempt to observe the expression of iRhom2 gene in HT patients, the its specific role in transport and hydrolysis activity of ADAM17, and the influence of Yiqi Huoxue Formula by using western blotting, confocal laser scanning microscopy, flow cytometry, Real time-PCR，ELISA, etc, in order to further elucidate the pathogenesis of HT and the mechanism of therapeutic effect of Yiqi Huoxue Fomula. We are sure that the result of this research subject will be of significant theoretical and practical importance.

出血性血小板病(HT)是一组血小板聚集异常性出血性疾病。中药益气活血方治疗该病疗效显著，但机理尚未完全阐明。本课题组长期致力HT研究，前期发现该病的vWF和凝血酶共同受体，血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ及其亚基GPIbα表达下调，主要原因是ADAM17过度水解GPIbα和GPⅤ胞外段功能区，导致血小板聚集不良。新近发现，ADAM17的上游分子伴侣iRhom2是ADAM17转运与蛋白水解的关键基因。iRhom2在内质网与ADAM17前体蛋白结合，一起转运至高尔基体，转化成熟ADAM17，最后定位于细胞膜，完成蛋白水解。为此本项目拟采用免疫印迹、激光共聚焦、流式细胞术、Real time-PCR等法观察iRhom2基因在HT中的表达及其特异性作用于ADAM17转运及水解的功能活性，并研究益气活血方的干预作用，以期进一步阐明HT发病机理和益气活血方作用靶点。

我们前期的研究发现，出血性血小板病（HT）患者血小板聚集不良的主要原因之一是ADAM17对凝血酶受体过度水解。理论上，iRhom2是调节ADAM17水解功能的关键分子。为此，本项目提出科学假说：iRhom2可能通过促进ADAM17介导凝血酶受体水解而参与HT的发病过程；调控iRhom2表达可能是中药益气活血方治疗HT的关键靶点之一。围绕研究假说，我们确定研究目标：验证iRhom2在HT的关键作用，以及调控ADAM17介导GPⅤ胞外段功能区水解的分子机制；探讨益气活血方对HT的 iRhom2/ADAM17信号通路表达调控机制。在项目实施过程中，根据国外有关出血性疾病的研究新进展，又设计并进行了miR-126在HT中的表达变化及益气活血方对其的影响的研究。本项目分为临床研究及体外实验二部分。临床研究显示，HT患者出血期iRhom2与ADAM17蛋白表达水平明显高于正常；miR-126表达水平及GP V的含量明显低于正常。益气活血方治疗8周后，iRhom2与ADAM17表达下降，miR-126表达及GP V的含量升高，与正常组比较差异无统计学意义。提示：iRhom2/ADAM17信号通路及miR-126参与了HT的病理过程；调控iRhom2/ADAM17信号通路及miR-126是益气活血方治疗HT关键作用靶点之一。体外拆方实验结果显示：在 HT患者静脉血体外加入益气活血方及其拆方共同孵育体系中，益气活血全方及其部分拆方组能使患者静脉血中iRhom2和GPⅤ恢复，接近正常水平；而单味中药组作用不明显。方中的主药黄芪与当归配伍为用，可降低iRhom2表达水平。综合本系列研究结果，出血性血小板病患者尽管血小板iRhom2/ADAM17信号通路表达异常增高，miR-126，GP V表达水平降低，但经过中药治疗后，却可以恢复正常。这就启迪我们，该病iRhom2/ADAM17信号通路，miR-126，或血小板膜糖蛋白受体异常可能不是结构上的缺陷和异常，而是一种可以逆转的功能异常。本项目开展，对于进一步阐明HT发病机制与益气活血方的作用靶点，具有重要的理论和临床意义。