RNA 5mC甲基转移酶复合物的鉴定和功能研究

RNAs function as regulatory and signaling molecules, amid which mRNAs encode proteins. The processing and metabolism of mRNAs including transcription, splicing, transport, localization and quality control, is regulated by cis- and trans- elements as well as certain types of chemical modifications on RNA. How RNA modifications modulate mRNA processing and metabolism is the most prevalent and significant scientific question in RNA biology, whereby, the key is to identify the methyltransferase complex of specific modifications and their functions. In our pioneering studies, we identified one methyltransferase component of the extensively spread 5mC methylation on mRNA, NSUN2; established the RNA 5mC bisulfite high-throughput sequencing technology as well as bioinformatics analysis procedures; unveiled distribution characteristics of mRNA 5mC and RNA species-associated with NSUN2; and found a regulatory role of NSUN2 in pre-adipocytes differentiation. By integrating multiple technologies ranging from molecular cell biology, biochemistry, chemical biology, to genomics and bioinformatics, we aim to identify the RNA 5mC methyltransferase complex and explore molecular mechanisms how RNA 5mC regulates mRNA alternative splicing and translation, by then illustrate biological significance of RNA methylations controlling mRNA processing and metabolism.

RNA具有调控和信息分子的双重功能，其中mRNA编码蛋白质。mRNA加工代谢机制包括了转录、剪接、转运、定位、质控等，受到顺式和反式元件及RNA化学修饰的调控，而RNA修饰如何调控mRNA加工代谢是近来RNA生物学研究的重大科学问题，关键是鉴定出RNA化学修饰的转移酶复合物及其功能。我们前期研究发现了一种mRNA广泛存在的甲基化修饰5mC的甲基转移酶催化亚基NSUN2，建立了RNA 5mC重亚硫酸盐-高通量测序技术及生物信息分析方法，初步鉴定了mRNA的5mC分布规律及NSUN2结合的RNA，发现了NSUN2调控脂肪前体细胞分化的重要功能。本项目拟整合分子细胞、生化，化学生物学、基因组和生物信息学交叉技术，重点鉴定RNA 5mC甲基转移酶复合物，阐明5mC修饰调控mRNA选择性剪接和翻译的机理，为RNA甲基化修饰调控mRNA加工和代谢提供新的理论依据。

m5C在RNA中广泛分布，早在上世纪70年代就已被发现存在于mRNA上，然而其分布规律和功能都尚未可知。本项目中我们首先建立改进的RNA m5C单碱基分辨率高通量测序与生物信息分析技术，揭示了mRNA m5C的分布规律，并绘制了精细的m5C修饰图谱，发现m5C在mRNA的翻译起始位点下游有显著富集，并且主要分布于CG富集区域。通过分析对比人和小鼠不同组织，发现m5C在mRNA上的分布特征在哺乳动物中十分保守，而在不同组织中修饰的基因具有特异性。利用UHPLC-MRM-MS/MS技术分析发现，NSUN2是催化mRNA上m5C形成的主要甲基转移酶，且其活性依赖于C271和C321关键氨基酸位点。利用oligo pull-down联合蛋白质谱分析，鉴定到m5C的结合蛋白为重要的mRNA出核相关因子ALYREF，暗示mRNA m5C修饰可能通过ALYREF调控mRNA出核过程。通过突变筛选实验发现ALYREF的K171是是结合m5C的关键氨基酸位点。进一步研究发现mRNA出核依赖NSUN2的甲基转移酶活性位点和ALYREF结合m5C位点，并通过mini基因报告系统证明m5C调控mRNA出核的重要机制。mRNA上m5C甲基转移酶NSUN2和其第一个结合蛋白的鉴定，以及m5C调控mRNA出核的重要机制的阐明，为进一步研究RNA甲基化调控的生物功能和RNA表观遗传提供依据，为研究与正常生理和异常病理生命活动关联分子机理提供新的表观调控研究方向。此外，我们同时还发现了RNA m6A修饰通过其结合蛋白YTHDF3促进mRNA翻译效率的分子机制。通过串联亲和沉淀的方法筛选YTHDF3和YTHDF1的互作蛋白，发现与其相互作用的主要是核糖体40S小亚基蛋白以及60S大亚基蛋白。通过GST pull-down实验证明YTHDF3与这些核糖体大亚基蛋白和小亚基蛋白存在相互作用。进一步的新蛋白合成实验证明了YTHDF3可以促进mRNA的翻译，因敲低YTHDF3引起的翻译水平的降低只能够被野生型的YTHDF3所回补。结合转录组和光交联-RNA测序及生物信息技术，证明YTHDF3和YTHDF1可以影响各自的RNA结合能力，同时发现YTHDF3促进YTHDF3与YTHDF1共同结合的转录本的翻译效率，揭示了YTHDF3和YTHDF1在翻译过程中的协同调控作用。