日本三角涡虫再生RNA表观遗传学研究

RNA m6A methylation plays important roles in regulating mRNA metabolism and biological functions. Planarian flatworm possesses an extraordinary ability to regenerate their whole bodies, thus the regulatory mechanism is always the hot research topic in the field of regenerative medicine. While whether RNA methylation exists in planarian mRNA and modulates planarian regeneration remains unreported to date. In our previous study, we found that m6A is enriched in mRNAs of Dugesia japonica and there are highly homologous mammalian m6A related enzymes and binding proteins in Dugesia japonica, indicating that m6A may be involved in planarian regeneration. By integrating multi-cross-disciplinary technologies, including molecular and cellular technology, biochemistry, genomics, high throughput m6A-miCLIP-seq and bioinformatics etc., this project aims at establishing the whole genome of Dugesia japonica, profiling the dynamic m6A methylation during regeneration, identifying methyltransferases, demethylases and binding proteins of Dugesia japonica, and unveiling the molecular mechanism of m6A mediated planarian regeneration. Clarifying the mechanism of m6A modification on regeneration will open up the vital functions of RNA modification in the area of planarian regeneration and provide compelling evidences for regenerative medicine.

RNA m6A甲基化修饰在mRNA加工代谢及生物学功能的调控中起着重要的作用。涡虫的再生能力极强，其调控新机制的发现一直是再生医学研究领域的研究热点和前沿。而RNA甲基化修饰是否存在于涡虫mRNA并调控涡虫再生，尚未有相关报道。在前期研究中，申请人以日本三角涡虫为研究对象，发现日本三角涡虫的mRNA中存在丰富的m6A修饰，且已知的哺乳动物m6A修饰酶及结合蛋白在涡虫中高度同源，这表明RNA m6A甲基化修饰可能参与日本三角涡虫的再生过程。本项目结合分子细胞、生物化学、基因组学、高通量m6A单位点测序和生物信息学等多学科交叉技术，构建日本三角涡虫的基因组，绘制再生过程的m6A修饰动态谱，鉴定m6A的修饰酶及结合蛋白，解析m6A调控涡虫再生过程的功能分子机制，开拓涡虫再生领域RNA修饰的重要功能，为再生医学提供新的理论依据。

本项目研究日本三角涡虫再生RNA表观遗传调控机制和功能，围绕组织器官再生这一重要生理过程，采用了具有全身再生能力和大量成体干细胞的涡虫作为研究模型来探索RNA表观遗传学调控机制。取得如下重要发现：完成了涡虫基因组高通量测序，初步尝试了基因组拼接。利用超高效液相色谱串联质谱技术鉴定到涡虫mRNA中存在着丰富的m6A修饰。通过转录组测序发现，m6A甲基转移酶复合物重要组分WTAP在涡虫再生过程呈现表达上调趋势；结合m6A甲基化测序，发现涡虫的再生与基因表达和m6A动态变化相关。通过dsRNA敲低wtap发现，神经系统和消化系统在内的涡虫多个组织器官的再生受损。通过RNA-seq和MeRIP-seq分析再生过程中的差异功能通路和基因，发现WTAP介导的m6A调控细胞周期和细胞通讯相关通路的重要基因，并与再生过程密切相关。进一步通过对野生型和wtap敲低条件下再生不同时间点的涡虫进行单细胞转录组测序，发现wtap敲低诱导产生了一种新的神经组细胞样细胞群（NP-like细胞），其特异性表达一种细胞通讯配体GRN。通过dsRNA敲低实验，发现双敲grn与wtap能回补wtap单敲导致的再生受阻现象。综上，本研究揭示了WTAP介导的m6A调控涡虫再生的机制：在涡虫体内稳态期间，grn的RNA表达水平保持在中等水平（0 hpa）以抑制过度生长，但在损伤后（6 hpa后），m6A修饰选择性靶向grn和细胞周期相关基因cdk7和cdk9进行降解，以抑制转录从而加速再生过程。wtap基因表达敲低后，导致grn表达上调并产生新的细胞簇，GRN分泌增加且与CDK9协同作用抑制转录，最终导致再生失败。本研究揭示了WTAP介导的m6A修饰在调节机体再生的神经细胞群的动力学和内稳态中的重要作用，为个体再生的表观调控提供了理论基础。