SMN1/2和NAIP基因拷贝数定量快速诊断SMA方法的建立及临床应用

脊髓性肌萎缩症(SMA)是一组常见的神经肌肉疾病，我国人群携带率高达1/42，居致死性常染色体隐性遗传病第二位。SMA发病的分子机制是SMA决定基因SMN1基因缺失，同时SMA修饰基因SMN2和NAIP的拷贝数目对SMA临床症状表型的严重程度也具有一定的影响。本项目利用连接酶模板预处理及多重TaqMan实时荧光PCR技术，采用定量检测SMN1/2和NAIP基因拷贝数，以直接分析SMA决定基因和修饰基因是否有缺失、缺失数量、及多拷贝的分子诊断策略，开发一种准确可靠、简单实用、高通量低成本，易于实现自动化和规模化检测的"基于SMN1/2和NAIP基因拷贝数直接定量"检测体系，并通过检测一定数量各类型SMA患者，总结此3个基因的不同基因型组合与SMA临床症状表型之间的规律，建立用于SMA诊断及分型的实验室诊断标准，满足当前SMA防治中大规模人群筛查、产前诊断和常规分子诊断的需要。

在本课题研究中，为了通过检测SMA相关基因的拷贝数变化诊断SMA，我们建立了多重TaqMan实时荧光定量PCR技术和CNVplex技术检测SMN1,SMN2和NAIP的拷贝数、同时采用了MLPA技术对这两种技术体系进行精密度、准确度与变异度等方法学的综合评估。为建立稳定可靠的四重单管TaqMan实时荧光定量PCR检测体系，我们主要针对SMA的决定基因SMN1，修饰基因SMN2和NAIP设计特异引物与探针，同时选取了与目的基因邻近的一段保守序列作为参比基因。92例经MLPA方法验证的各基因型SMA标本用来评价该体系，检测结果准确性达到了100%。同时所选取的扩增目的DNA序列、引物和探针经实验验证，特异性高，所选择的∆Ct相对定量分析模式能够准确分型，不同目的基因不同拷贝数间的2－∆∆Ct值差异明显，比值间没有重叠。为建立稳定可靠的CNVplex检测体系，我们针对SMN1,SMN2和NAIP基因以及参比序列设计引物探针，建立并优化SMA检测体系。此外，我们利用MLPA技术对比分析42例SMA患者与212例健康对照的拷贝数变化与基因结构，结果表明中国SMA患者与正常对照的SMN2与NAIP基因的分布均有显著性差异，并首次发现了三种异常的基因结构。另外我们还选取了320例含SMA相关基因不同拷贝数的样本进行了荧光定量PCR，MLPA和CNVplex的方法学对比和评价。结果表明自建的四重单管TaqMan实时荧光定量PCR体系具有高灵敏度，高特异性，简单、快速、高通量、低成本、结果稳定可靠等优点，这将会对当前SMA防治中大规模人群筛查、产前诊断和常规分子诊断具有重要意义。