酿酒酵母呈香乙基酯合成代谢调控研究

Aroma-active ethyl esters play a key role in the sensorial quality of fermented alcoholic beverages. Saccharomyces cerevisiae release very low level of ethyl esters during fermentation, for example, ethyl esters are produced mainly from wild yeast and pit-mud microbes during traditional Chinese liquor fermentation, which results in the problems of high grain cost, long fermentation period, and bad sanitary condition. Breeding of higher ethyl esters producing Saccharomyces cerevisiae is helpful to maintain and improve the quality of alcoholic beverages such as beer and wine, and is especially important to the fermentation process reformation of Chinese liquor making. The level of Medium-chain acyl-CoA（MCA-CoA）is the speed-limiting factor in ethyl esters biosynthesis reaction. In this research, based on the modular pathway optimization strategy，we will first divide the MCA-CoA de novo synthesis pathway into three modules，Acetyl-CoA synthesis module（upstream module），Malonyl-CoA synthesis module（ midstream module）and MCA-CoA synthesis module（downstream module），and then optimize these three modules individually with COMPACTER strategy. After the optimized modules with different expression level were obtained, we will assembly these three optimized modules combinationally into Saccharomyces cerevisiae EY15, one EHT1 overexpressing strain we constructed before, to construct de novo MCA-CoA synthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae and finally get series ethyl esters overproducing strains. The optimized Acetyl-CoA synthesis module and Malonyl-CoA synthesis module will be meaningful for the biosynthesis of other industially interesting chemicals like isoprenoids, polyketides and lipids. The mechanism of inhibition effect of intracellular acetic acid on higher alcohols biosynthesis, and the mechanism of chain length control of fatty acid de novo synthesis will also be researched.

己酸乙酯等呈香乙基酯，对酒类饮品风味质量至关重要。选育适量高产乙基酯的酿酒酵母，对于酒类产品质量稳定与提高和中国白酒传统酿造工艺革新具有重要意义。酿酒酵母乙基酯产生能力低下，中链脂酰辅酶A生成量不足是其直接原因。本研究拟利用模块化途径优化策略，将中链脂酰辅酶A从头合成途径分为上游乙酰辅酶A合成、中游丙二酸单酰辅酶A合成和下游中链脂酰辅酶A合成三个模块，先从转录水平对各模块的表达进行精细调控，得到不同表达水平的上、中、下游模块，再将这三类模块组合装配入前期构建的EHT1过表达突变株EY15中，筛选中链乙基酯合成能力提高的酿酒酵母突变株，以期在酿酒酵母中成功构建中链乙基酯从头合成途径，为酒品质量稳定与改善，乃至酿酒工艺革新提供理论和技术支撑。上、中游模块优化可为以乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A为前体的生物合成过程提供经验借鉴。研究中还将对乙酸抑制高级醇生成机制和脂肪酸合成链长控制机制进行解析。

风味酯是重要的一类呈香化合物，其在酒类饮品中主要分为两类，一类是以乙酸乙酯和乳酸乙酯为主的乙酸酯，另一类是以己酸乙酯和丁酸乙酯为主的中短链乙基酯（C4-C10）。选育适量高产风味酯的酿酒酵母，对于稳定和提高酒类产品质量以及对中国白酒传统酿造工艺革新都具有重要意义。在酿酒酵母中，酯类物质主要是以酰基辅酶A和乙醇作为底物通过醇酰转移酶（AATase）催化而成。因此，本项目主要从提高酰基辅酶A的底物浓度和强化AATase的催化活力两个方向出发对酿酒酵母细胞进行改造，从而赋予了酿酒酵母合成各种风味酯的能力。对于乙酸乙酯的合成，我们首先通过对PDH旁路两个关键酶基因ACS1和ALD6的表达水平进行组合优化，强化了胞浆乙酰辅酶A的合成水平，乙酰辅酶A的含量最高达36.68 nmol/107CFU，随后敲除了部分基因，一定程度上阻断了丙酮酸和乙酰辅酶A到线粒体的运输，并且引入了高催化活性的AATase基因，最终乙酸乙酯的产量达1.61 g/L。对于中链乙基酯的合成，我们在胞浆乙酰辅酶A合成强化的基础上，进一步通过构建的丙二酸单酰辅酶A传感器强化了丙二酸单酰辅酶A的合成和中链脂酰基辅酶A的合成能力，最后外源引入了对己酸乙酯合成有较好的催化效果的草莓来源的AATase基因SAAT，最终己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的产量分别达到11.97、17.19 和17.32 mg/L。为了使得酿酒酵母产丁酸乙酯，我们首次引入了丁酰辅酶A的合成通路，随后引入了三种不同来源的醇酰基转移酶基因，对于该过程的限速步骤Bcd酶，我们用Ter酶代替。最后对关键基因进行二拷贝处理后，丁酸乙酯的产量达到99.65 mg/L。对于乳酸乙酯的合成，我们首先在酿酒酵母中引入了Ldhl1和Pct酶，随后引入外源AATase，并对以上关键基因进行了二拷贝和三拷贝处理，最后部分阻断了胞浆丙酮酸到线粒体的运输，乳酸乙酯的产量达到420.48 mg/L。这些产不同风味酯酿酒酵母菌株的构建，在改善酒精饮料的风味质量等方面具有一定的应用价值，也为其它各种风味酯的合成强化奠定了理论基础。