代谢木糖合成人参皂苷酿酒酵母构建及调控机制研究

Ginsenoside is the main bioactive ingredient of ginseng. We have achieved protopanaxadiol (PPD), the precursor of ginsenoside, production by reconstruction the biosynthetic pathway of PPD in Saccharomyces cerevisiae (SC). We also found that the PPD yield was higher when xylose was used as the substrate for PPD production compared to glucose and the crabtree effect made the cell accumulate ethanol when the glucose was selected as the substrate. However, the mechanisms are unstated. Ethanol is prone to induce active oxygen production which was toxic to the cell. Therefore, this research is aimed to engineer SC to produce ginsenoside Rh2 by metabolizing xylose with the aid of synthetic biology. To increase the yield of PPD and Rh2, the precursor acetyl-COA and UDP-glucose supply were enhanced by MVA pathway reconstruction and optimization in organelles and cytoplasm. The mechanism of triterpene production by SC metabolizing xylose is interpreted by the analysis of various Rh2 production strains which are constructed by quantitative disturbance of xylose transportation and metabolism with the aid of multi- omics and 13C metabolic flux analysis; the potential targets found and mechanism interpreted in this study can provide foundation for the rational design of other terpenoids synthesis in SC with xylose.

人参皂苷是人参的主要功效成分，本实验室通过在酿酒酵母中重构原人参二醇（PPD）合成途径，实现了人参皂苷前体PPD的合成，进而发现，利用木糖比葡萄糖可获得更高PPD得率，然而其机制尚不明确，且酿酒酵母代谢葡萄糖易积累乙醇进而导致活性氧生成，造成细胞毒性。本研究拟通过合成生物学技术构建可利用木糖合成人参皂苷Rh2（3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-PPD）的酿酒酵母细胞，通过细胞器工程结合胞质途径优化增加Rh2合成前体PPD及UDP-葡萄糖的供应，强化酿酒酵母细胞PPD及Rh2的合成能力；通过调控木糖运输及代谢模块表达强度，建立木糖代谢强度与Rh2合成效率之间的定量关系，进一步利用组学技术及13C代谢流技术绘制差异化酿酒酵母细胞代谢调控图谱，阐释酿酒酵母代谢木糖合成Rh2的代谢调控机理，寻找潜在的代谢调控靶点，为其他萜类化合物酿酒酵母代谢木糖合成提供理性设计依据。

木糖作为一种木质纤维素水解产物，来源丰富，但微生物利用效率不高，研究发现工程酿酒酵母可利用木糖为碳源高效合成人参皂苷，但其机制不明。本研究利用合成生物学技术重构了适宜酵母表达的木糖代谢模块、原人参二醇PPD代谢模块，实现了酵母以木糖为底物从头合成人参皂苷PPD，其发酵产量达到380.8 mg/L；通过导入来自黑曲霉的转氢酶NNT，平衡木糖代谢过程中的NADH/NADPH辅因子代谢，使工程菌株以木糖为底物合成413.6 mg/L PPD。研究了利用酿酒过氧化物酶体合成萜类化合物的潜力，将MVA途径构建到酿酒酵母过氧化物酶体中，使酿酒酵母合成倍半萜的能力提高了1.9倍。比较了不同来源木糖转运蛋白，对工程菌株底物消耗、菌体生长以及人参皂苷合成的影响，发现来源于热带假丝酵母的Cstp1木糖转运蛋白，可以提高工程菌株木糖利用效率（提高约4倍），但是随着木糖利用效率的提高，造成了碳代谢流的分配不平衡，使人参皂苷PPD的产量逐渐下降，菌体生长明显加快。进一步构建了人参皂苷Rh2代谢模块，结合强化糖基供体UDP-葡萄糖合成模块，使酿酒酵母以木糖为底物可合成153.2 mg/L的人参皂苷Rh2，通过利用木糖条件下强启动子表达MVA途径限速基因以及糖基供体模块，使人参皂苷Rh2的产量提高至209.5 mg/L。乙醇是酿酒酵母葡萄糖或木糖代谢条件下中间产物，同时后期也作为底物合成人参皂苷，基于13C代谢流分析，表明酿酒酵母以乙醇为碳源时，NADPH的供应是合成三萜人参皂苷的关键，结合转录组与代谢组分析表明，酿酒酵母以木糖为底物时，甲羟戊酸途径关键基因显著上调，甾醇途径合成基因显著下调，是人参皂苷Rh2以木糖为底物高效合成的重要原因，同时发现木糖代谢环境下嘧啶代谢途径中间产物积累量下降是限制人参皂苷Rh2合成重要因素，为后续改造酿酒酵母代谢木糖高效合成其他皂苷类化合物提供了潜在改造靶点及理性设计依据。