胁迫条件下酿酒酵母蛋白酶A胞外分泌机制研究

In this project, we will conduct systematic researches to explan the Extracellular Secretory Mechanism of Proteinase A (ESMPrA) in Sacchromyces cerevisiae under stress conditions like the later phase of beer fermentation. The explanation of the ESMPrA will not only be helpful to understand the biochemical details of the General Stress Response, but also with theoretical importance for the strains improvement, process control and products quality control of fermentation products such as beer, Chinese yellow wine and wine.Firstly, we will study the effects of PrA expression level, vacuole sorting signal receptor expression level and sorting signal strengths on PrA extracellular secretory using traditional molecular biotechnology techniques, to find the trigger mechanisms of the extracellular secretory of PrA. This part of work will find the direct manipulate target for the controlling of PrA extracellular secretory.Secondary, we will trace the dynamic process of secretion and the final sub-cellular localization of PrA with GFP tagging, screen and identify the interaction proteins in the PrA extracellular secretory pathway using TAP-MS, CoIP and Yeast Two-hybrid systems, at last show the detail protein components of PrA extracellular secretory pathway. Lastly, we will try to find the genes with different expression level under different conditions (stress and non-stress) using cDNA arrays systems, explore the connection between the different expression of these genes and the PrA extracellular secretory, and finally find the regulation mechanism of PrA secretion under different stress conditions.

研究酿酒酵母蛋白酶A（PrA）在胁迫条件下的胞外分泌机制,即有助于揭示胁迫应激反应及相关细胞活动的生化本质，又可为啤酒、黄酒、葡萄酒等发酵产品的菌种选育、工艺与产品质量控制提供理论指导，具有重要的理论意义和应用价值。本项目拟从三个方面探索胁迫条件下PrA胞外分泌机制。首先从影响PrA液泡分选的PrA表达量、分选信号受体表达量和前肽分选信号强度三个关键因素出发，利用分子生物学方法，找出胁迫条件下PrA外泌引发机制，为控制PrA外泌找到最直接靶点。其次，通过绿色荧光蛋白标签及其成像技术，追踪PrA外泌动态过程和亚细胞定位;通过串联亲和层析-质谱联用、免疫共沉淀和酵母双杂交等手段分离鉴定外泌途径中互作蛋白，揭示胁迫条件下PrA外泌途径的具体构成。最后，通过DNA芯片技术，鉴定出不同胁迫条件下差异表达基因，建立其与PrA表达、外泌相关性，从基因水平上揭示胁迫条件下PrA表达、外泌的调控机制。

研究酿酒酵母蛋白酶A（PrA）在胁迫条件下的胞外分泌机制,即有助于揭示胁迫应激反应及相关细胞活动的生化本质，又可为啤酒、黄酒、葡萄酒等发酵产品的菌种选育、工艺与产品质量控制提供理论指导，具有重要的理论意义和应用价值。本研究首先对发酵胁迫条件下蛋白酶A胞外分泌引发机制进行探索，通过构建蛋白酶A前肽缺失突变株和其编码基因(PEP4)缺失突变株，研究改变液泡分选信号的质（信号强度）和量（蛋白酶A表达量）对蛋白酶A胞外分泌的影响，确定了蛋白酶A液泡分选信号的质量是引发蛋白酶A胞外分泌的一个重要因素。同时，通过缺失和过表达液泡分选信号识别受体基因（VPS10、MRL1），研究胁迫条件下信号识别受体表达量变化对蛋白酶A液泡分选和胞外分泌的影响，确定了分选受体的表达量直接影响了蛋白酶A从高尔基体到液泡的分选效率，从而间接对蛋白酶A的外泌造成影响，并确认了Vps10的主导地位。最终确定了蛋白酶A的表达相对过量（对于液泡分选受体表达量而言）是蛋白酶A胞外分泌的直接引发机制。其次，通过构建各主要外泌环节结构蛋白因子（SEC4,SEC5, YPT31 /32）缺失菌株，验证其对胞外分泌的影响，进一步确定蛋白酶A分泌所必经各个环节，初步确认了组成型胞外分泌途径在蛋白酶A外泌中的作用，以及胁迫条件下PrA外泌途径的具体构成。最后，研究了细胞器以及细胞质中钙离子稳态对蛋白质的分选以及外泌的调节机制，通过构建调节钙稳态的相关基因（PMR1, PMC1, VCX1,YVC1）缺失突变株，初步确认了维持钙稳态的相关钙通道蛋白对蛋白酶A胞外分泌起一定的调节作用。本研究确认了蛋白酶A胞内运输和外泌的多个细节，为酿酒酵母蛋白酶A的外泌调控（低产/高产）找到了多个有效靶点，可为啤酒、黄酒、葡萄酒等发酵饮品的感官、风味、营养和安全质量控制提供必要的理论支持，也为钙相关的蛋白分泌机制的深入解析奠定了一定基础。